安徽医科大学学报
安徽醫科大學學報
안휘의과대학학보
ACTA UNIVERSITY MEDICINALIS ANHUI
2012年
3期
229-233
,共5页
王中安%邹文艺%刘磊%范清林%宋礼华
王中安%鄒文藝%劉磊%範清林%宋禮華
왕중안%추문예%류뢰%범청림%송례화
甲硫氨酸氨基肽酶%干扰素-α2b%N端甲硫氨酸%基因表达%大肠杆菌
甲硫氨痠氨基肽酶%榦擾素-α2b%N耑甲硫氨痠%基因錶達%大腸桿菌
갑류안산안기태매%간우소-α2b%N단갑류안산%기인표체%대장간균
目的 构建重组大肠杆菌甲硫氨酸氨基肽酶(reMAP)的原核表达体系,并利用表达的reMAP切除重组人干扰素-α2b(rhIFN-α2b)N末端的初始甲硫氨酸.方法 将PCR扩增得到的大肠杆菌MAP基因克隆到表达载体质粒pACYCDuet-1中,并在宿主菌E.coli BL21中通过IPTG诱导进行可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot分析及活性检测后,通过两种方法作用rhIFN-α2b:① 将纯化后reMAP和rhIFN-α2b在体外适当的缓冲液中作用;② 构建reMAP和rhIFN-α2b的共表达体系,实现在细胞内对rhIFN-α2b进行作用,并对两种作用方式的结果进行比较.结果 reMAP和rhIFN-α2b均得到正确表达,酶活性检测结果表明reMAP具有水解N端甲硫氨酸的活性,两种方法作用后的rhIFN-α2b经氨基酸序列测定后显示N端起始甲硫氨酸均被切除,其中体内作用切除率＞94%、体外作用切除率＞96%.结论 reMAP可以用于 rhIFN-α2b N末端的初始甲硫氨酸的切除.
目的 構建重組大腸桿菌甲硫氨痠氨基肽酶(reMAP)的原覈錶達體繫,併利用錶達的reMAP切除重組人榦擾素-α2b(rhIFN-α2b)N末耑的初始甲硫氨痠.方法 將PCR擴增得到的大腸桿菌MAP基因剋隆到錶達載體質粒pACYCDuet-1中,併在宿主菌E.coli BL21中通過IPTG誘導進行可溶性錶達,經SDS-PAGE和Western blot分析及活性檢測後,通過兩種方法作用rhIFN-α2b:① 將純化後reMAP和rhIFN-α2b在體外適噹的緩遲液中作用;② 構建reMAP和rhIFN-α2b的共錶達體繫,實現在細胞內對rhIFN-α2b進行作用,併對兩種作用方式的結果進行比較.結果 reMAP和rhIFN-α2b均得到正確錶達,酶活性檢測結果錶明reMAP具有水解N耑甲硫氨痠的活性,兩種方法作用後的rhIFN-α2b經氨基痠序列測定後顯示N耑起始甲硫氨痠均被切除,其中體內作用切除率＞94%、體外作用切除率＞96%.結論 reMAP可以用于 rhIFN-α2b N末耑的初始甲硫氨痠的切除.
목적 구건중조대장간균갑류안산안기태매(reMAP)적원핵표체체계,병이용표체적reMAP절제중조인간우소-α2b(rhIFN-α2b)N말단적초시갑류안산.방법 장PCR확증득도적대장간균MAP기인극륭도표체재체질립pACYCDuet-1중,병재숙주균E.coli BL21중통과IPTG유도진행가용성표체,경SDS-PAGE화Western blot분석급활성검측후,통과량충방법작용rhIFN-α2b:① 장순화후reMAP화rhIFN-α2b재체외괄당적완충액중작용;② 구건reMAP화rhIFN-α2b적공표체체계,실현재세포내대rhIFN-α2b진행작용,병대량충작용방식적결과진행비교.결과 reMAP화rhIFN-α2b균득도정학표체,매활성검측결과표명reMAP구유수해N단갑류안산적활성,량충방법작용후적rhIFN-α2b경안기산서렬측정후현시N단기시갑류안산균피절제,기중체내작용절제솔＞94%、체외작용절제솔＞96%.결론 reMAP가이용우 rhIFN-α2b N말단적초시갑류안산적절제.
