中华消化杂志
中華消化雜誌
중화소화잡지
Chinese Journal of Digestion
2004年
1期
7-10
,共4页
刘文滨%王吉耀%杨长青%王逸青%蒋炜%贺伯明%郭津生
劉文濱%王吉耀%楊長青%王逸青%蔣煒%賀伯明%郭津生
류문빈%왕길요%양장청%왕일청%장위%하백명%곽진생
肝星形细胞%TIMP-1%Ⅰ型胶原%Ⅲ型胶原
肝星形細胞%TIMP-1%Ⅰ型膠原%Ⅲ型膠原
간성형세포%TIMP-1%Ⅰ형효원%Ⅲ형효원
目的探讨体外构建的反义金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)表达质粒在大鼠肝星形细胞(HSC)中的表达情况及对HSC活化后Ⅰ、Ⅲ型胶原量的影响.方法双酶灌注和梯度离心法分离正常大鼠HSC,培养7～10 d后活化为肌成纤维样母细胞表型.应用巢式RT-PCR和基因重组技术构建能在真核细胞中表达的反义TIMP-1质粒并测序鉴定.应用脂质体介导重组质粒和pcDNA3空质粒转染HSC,经含400 μg/ml G418的DMEM培养液筛选3～4周,另设立空白对照组.Northern blot和Western blot检测筛选后的HSC中TIMP-1表达情况;用FITC标记的Ⅰ型胶原为底物测定培养上清液内间质胶原酶活性;应用Western blot方法对HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原进行半定量分析.结果外源重组质粒能较大程度地抑制活化HSC中TIMP-1的表达,而pcDNA3空质粒和空白对照组则无类似结果.TIMP-1/GAPDH比值分别为0.67,2.41和2.97(mRNA水平,P＜0.05).TIMP-1/β-actin比值分别为0.31,0 98和1.32(蛋白质水平,P＜0.05).外源重组质粒转染显著提高了间质胶原酶活性,酶活性分别为0.3049,0.1411和0.1196(P＜0.05).HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原量明显减少.Ⅰ型胶原/β-actin比值分别为0.63,1.78和1.92(P＜0.05).Ⅲ型胶原/β-actin比值分别为0.59,1.81和1.98(P＜0.05).结论反义TIMP-1重组质粒可在HSC中获得稳定表达,并可大幅提高HSC培养液中间质胶原酶的活性,这就有可能提高对Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解能力,减少HSC中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量,从而减少了以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质(ECM)过度沉积,为肝纤维化的逆转提供一个新的思路和方法.
目的探討體外構建的反義金屬蛋白酶組織抑製因子(TIMP-1)錶達質粒在大鼠肝星形細胞(HSC)中的錶達情況及對HSC活化後Ⅰ、Ⅲ型膠原量的影響.方法雙酶灌註和梯度離心法分離正常大鼠HSC,培養7～10 d後活化為肌成纖維樣母細胞錶型.應用巢式RT-PCR和基因重組技術構建能在真覈細胞中錶達的反義TIMP-1質粒併測序鑒定.應用脂質體介導重組質粒和pcDNA3空質粒轉染HSC,經含400 μg/ml G418的DMEM培養液篩選3～4週,另設立空白對照組.Northern blot和Western blot檢測篩選後的HSC中TIMP-1錶達情況;用FITC標記的Ⅰ型膠原為底物測定培養上清液內間質膠原酶活性;應用Western blot方法對HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原進行半定量分析.結果外源重組質粒能較大程度地抑製活化HSC中TIMP-1的錶達,而pcDNA3空質粒和空白對照組則無類似結果.TIMP-1/GAPDH比值分彆為0.67,2.41和2.97(mRNA水平,P＜0.05).TIMP-1/β-actin比值分彆為0.31,0 98和1.32(蛋白質水平,P＜0.05).外源重組質粒轉染顯著提高瞭間質膠原酶活性,酶活性分彆為0.3049,0.1411和0.1196(P＜0.05).HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原量明顯減少.Ⅰ型膠原/β-actin比值分彆為0.63,1.78和1.92(P＜0.05).Ⅲ型膠原/β-actin比值分彆為0.59,1.81和1.98(P＜0.05).結論反義TIMP-1重組質粒可在HSC中穫得穩定錶達,併可大幅提高HSC培養液中間質膠原酶的活性,這就有可能提高對Ⅰ、Ⅲ型膠原的降解能力,減少HSC中Ⅰ、Ⅲ型膠原的含量,從而減少瞭以Ⅰ、Ⅲ型膠原為主的細胞外基質(ECM)過度沉積,為肝纖維化的逆轉提供一箇新的思路和方法.
목적탐토체외구건적반의금속단백매조직억제인자(TIMP-1)표체질립재대서간성형세포(HSC)중적표체정황급대HSC활화후Ⅰ、Ⅲ형효원량적영향.방법쌍매관주화제도리심법분리정상대서HSC,배양7～10 d후활화위기성섬유양모세포표형.응용소식RT-PCR화기인중조기술구건능재진핵세포중표체적반의TIMP-1질립병측서감정.응용지질체개도중조질립화pcDNA3공질립전염HSC,경함400 μg/ml G418적DMEM배양액사선3～4주,령설립공백대조조.Northern blot화Western blot검측사선후적HSC중TIMP-1표체정황;용FITC표기적Ⅰ형효원위저물측정배양상청액내간질효원매활성;응용Western blot방법대HSC중Ⅰ、Ⅲ형효원진행반정량분석.결과외원중조질립능교대정도지억제활화HSC중TIMP-1적표체,이pcDNA3공질립화공백대조조칙무유사결과.TIMP-1/GAPDH비치분별위0.67,2.41화2.97(mRNA수평,P＜0.05).TIMP-1/β-actin비치분별위0.31,0 98화1.32(단백질수평,P＜0.05).외원중조질립전염현저제고료간질효원매활성,매활성분별위0.3049,0.1411화0.1196(P＜0.05).HSC중Ⅰ、Ⅲ형효원량명현감소.Ⅰ형효원/β-actin비치분별위0.63,1.78화1.92(P＜0.05).Ⅲ형효원/β-actin비치분별위0.59,1.81화1.98(P＜0.05).결론반의TIMP-1중조질립가재HSC중획득은정표체,병가대폭제고HSC배양액중간질효원매적활성,저취유가능제고대Ⅰ、Ⅲ형효원적강해능력,감소HSC중Ⅰ、Ⅲ형효원적함량,종이감소료이Ⅰ、Ⅲ형효원위주적세포외기질(ECM)과도침적,위간섬유화적역전제공일개신적사로화방법.
