诊断学理论与实践
診斷學理論與實踐
진단학이론여실천
JOURNAL OF DIAGNOSTICS CONCEPTS & PRACTICE
2009年
6期
631-634
,共4页
贾兴元%韩瀚%肖白%高斌%周淑佩%刘冕%刘敬忠
賈興元%韓瀚%肖白%高斌%週淑珮%劉冕%劉敬忠
가흥원%한한%초백%고빈%주숙패%류면%류경충
实时聚合酶链反应%变性高效液相色谱%基因突变%检测%苯丙酮尿症模型小鼠
實時聚閤酶鏈反應%變性高效液相色譜%基因突變%檢測%苯丙酮尿癥模型小鼠
실시취합매련반응%변성고효액상색보%기인돌변%검측%분병동뇨증모형소서
目的:建立融解曲线法和变性高效液相色谱(DHPLC)法准确、快速地鉴定苯丙酮尿症(PKU)模型小鼠的基因型.方法:融解曲线法采用聚合酶链反应(PCR)扩增包含模型小鼠pah基因点突变位点序列的132 bp片段,将该产物予Alw 26I酶切后,加入微量SYBR Green I,在实时PCR仪上行融解曲线分析,同时,酶切产物行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.DHPLC法是直接将132 bp片段扩增产物采用在部分变性条件下(60.9℃)行DHPLC分析,根据不同图谱作出基因型诊断.结果:融解曲线分析表明,野生型小鼠的DNA片段在84℃和81℃出现2个融解峰,突变纯合型小鼠DNA片段在76.5～77.5℃和81℃出现2个融解峰,杂合型小鼠DNA片段则在84℃、81℃和76.5～77.5℃均出现融解峰,3种峰型明显可被区分.DHPLC优化了最佳分离效果的柱温,在优化的最佳条件下,DHPLC图谱显示杂合型小鼠DNA具有显著特色的峰型,即除同源双链峰外,出现一个异源双链峰.上述2种新方法共检测了PKU模型小鼠突变纯合型20只、杂合型22只,野生型11只,2种方法检测结果一致,并且与经典的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法结果一致(动物毛色等表型也完全一致).结论:融解曲线法和DHPLC法均能准确、快速地鉴定模型小鼠的基因型,具有自动化、高通量等优点.
目的:建立融解麯線法和變性高效液相色譜(DHPLC)法準確、快速地鑒定苯丙酮尿癥(PKU)模型小鼠的基因型.方法:融解麯線法採用聚閤酶鏈反應(PCR)擴增包含模型小鼠pah基因點突變位點序列的132 bp片段,將該產物予Alw 26I酶切後,加入微量SYBR Green I,在實時PCR儀上行融解麯線分析,同時,酶切產物行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分析.DHPLC法是直接將132 bp片段擴增產物採用在部分變性條件下(60.9℃)行DHPLC分析,根據不同圖譜作齣基因型診斷.結果:融解麯線分析錶明,野生型小鼠的DNA片段在84℃和81℃齣現2箇融解峰,突變純閤型小鼠DNA片段在76.5～77.5℃和81℃齣現2箇融解峰,雜閤型小鼠DNA片段則在84℃、81℃和76.5～77.5℃均齣現融解峰,3種峰型明顯可被區分.DHPLC優化瞭最佳分離效果的柱溫,在優化的最佳條件下,DHPLC圖譜顯示雜閤型小鼠DNA具有顯著特色的峰型,即除同源雙鏈峰外,齣現一箇異源雙鏈峰.上述2種新方法共檢測瞭PKU模型小鼠突變純閤型20隻、雜閤型22隻,野生型11隻,2種方法檢測結果一緻,併且與經典的聚閤酶鏈反應-限製性片段長度多態性(PCR-RFLP)法結果一緻(動物毛色等錶型也完全一緻).結論:融解麯線法和DHPLC法均能準確、快速地鑒定模型小鼠的基因型,具有自動化、高通量等優點.
목적:건립융해곡선법화변성고효액상색보(DHPLC)법준학、쾌속지감정분병동뇨증(PKU)모형소서적기인형.방법:융해곡선법채용취합매련반응(PCR)확증포함모형소서pah기인점돌변위점서렬적132 bp편단,장해산물여Alw 26I매절후,가입미량SYBR Green I,재실시PCR의상행융해곡선분석,동시,매절산물행12%취병희선알응효전영분석.DHPLC법시직접장132 bp편단확증산물채용재부분변성조건하(60.9℃)행DHPLC분석,근거불동도보작출기인형진단.결과:융해곡선분석표명,야생형소서적DNA편단재84℃화81℃출현2개융해봉,돌변순합형소서DNA편단재76.5～77.5℃화81℃출현2개융해봉,잡합형소서DNA편단칙재84℃、81℃화76.5～77.5℃균출현융해봉,3충봉형명현가피구분.DHPLC우화료최가분리효과적주온,재우화적최가조건하,DHPLC도보현시잡합형소서DNA구유현저특색적봉형,즉제동원쌍련봉외,출현일개이원쌍련봉.상술2충신방법공검측료PKU모형소서돌변순합형20지、잡합형22지,야생형11지,2충방법검측결과일치,병차여경전적취합매련반응-한제성편단장도다태성(PCR-RFLP)법결과일치(동물모색등표형야완전일치).결론:융해곡선법화DHPLC법균능준학、쾌속지감정모형소서적기인형,구유자동화、고통량등우점.
