清华大学学报(自然科学版)
清華大學學報(自然科學版)
청화대학학보(자연과학판)
Journal of Tsinghua University
2008年
9期
1499-1503
,共5页
安明%于慧敏%罗晖%宋文斯%沈忠耀
安明%于慧敏%囉暉%宋文斯%瀋忠耀
안명%우혜민%라휘%송문사%침충요
7-氨基头孢烷酸%头孢菌素C酰化酶%重组大肠杆菌%基因合成%装配聚合酶链式反应%高表达
7-氨基頭孢烷痠%頭孢菌素C酰化酶%重組大腸桿菌%基因閤成%裝配聚閤酶鏈式反應%高錶達
7-안기두포완산%두포균소C선화매%중조대장간균%기인합성%장배취합매련식반응%고표체
7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是头孢菌素类抗生素的中间体,在医药工业中具有重要的应用价值.该文通过人工设计、合成并在重组大肠杆菌中表达头孢菌素C(CPC)酰化酶基因来实现7-ACA的一步酶法催化合成.以Pseudomonas sp.SE83菌株的CPC酰化酶蛋白质序列为模板.对CPC酰化酶基因分两段进行了全局优化设计,包括密码子替换、鸟嘌呤和胞嘧啶含量调整以及酶切位点修改等.通过装配聚合酶链式反应方法最终获得了目标基因,并克隆至表达载体pET-28a,成功构建了诱导型重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28-acy.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导,在Luria-Bertani培养基中,新建重组大肠杆菌所表达的可溶CPC酰化酶占菌体总蛋白的75%以上;经优化培养基摇瓶发酵,重组菌的CPC酰化酶酶活高达2 956U/L.采用上述方法获得的CPC酰化酶,在一步酶法合成7-ACA的工业化生产中具有广阔的应用前景.
7-氨基頭孢烷痠(7-ACA)是頭孢菌素類抗生素的中間體,在醫藥工業中具有重要的應用價值.該文通過人工設計、閤成併在重組大腸桿菌中錶達頭孢菌素C(CPC)酰化酶基因來實現7-ACA的一步酶法催化閤成.以Pseudomonas sp.SE83菌株的CPC酰化酶蛋白質序列為模闆.對CPC酰化酶基因分兩段進行瞭全跼優化設計,包括密碼子替換、鳥嘌呤和胞嘧啶含量調整以及酶切位點脩改等.通過裝配聚閤酶鏈式反應方法最終穫得瞭目標基因,併剋隆至錶達載體pET-28a,成功構建瞭誘導型重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET28-acy.經異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導,在Luria-Bertani培養基中,新建重組大腸桿菌所錶達的可溶CPC酰化酶佔菌體總蛋白的75%以上;經優化培養基搖瓶髮酵,重組菌的CPC酰化酶酶活高達2 956U/L.採用上述方法穫得的CPC酰化酶,在一步酶法閤成7-ACA的工業化生產中具有廣闊的應用前景.
7-안기두포완산(7-ACA)시두포균소류항생소적중간체,재의약공업중구유중요적응용개치.해문통과인공설계、합성병재중조대장간균중표체두포균소C(CPC)선화매기인래실현7-ACA적일보매법최화합성.이Pseudomonas sp.SE83균주적CPC선화매단백질서렬위모판.대CPC선화매기인분량단진행료전국우화설계,포괄밀마자체환、조표령화포밀정함량조정이급매절위점수개등.통과장배취합매련식반응방법최종획득료목표기인,병극륭지표체재체pET-28a,성공구건료유도형중조대장간균E.coli BL21(DE3)/pET28-acy.경이병기-β-D-류대반유당감유도,재Luria-Bertani배양기중,신건중조대장간균소표체적가용CPC선화매점균체총단백적75%이상;경우화배양기요병발효,중조균적CPC선화매매활고체2 956U/L.채용상술방법획득적CPC선화매,재일보매법합성7-ACA적공업화생산중구유엄활적응용전경.
