CAJ | 학술논문

1型1-磷酸鞘氨醇受体(S1P1)是淋巴细胞表面的重要受体.为研究S1P1中ERY保守基序与FTY720诱导其内化的关系.以HA-S1P1-Myc-EGFP-N1为模板,应用重叠PCR的方法,将S1P1第142位的Arg(R)突变为Asn(N),连同N端HA标签一起,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体.同时PCR扩增野生型S1P1,克隆人pcDNA3·1(+)中.限制性酶切消化、PCR和测序鉴定后,经Polyfect转染入HEK293细胞.G418筛选出稳定细胞株.100 nmol/LFTY720处理12 h后,抗HA-PE抗体染色,用流式细胞仪检测S1P1在HEK293细胞上的表达情况.结果显示HA-S1P1(WT)-pcDNA3.1(+)和HA-S1P1(R142N)-pcDNA3.1(+)载体被成功构建,HA-S1P1(WT)和HA-S1P1(R142N)蛋白表达在HEK293稳定细胞株的表面.FTY720能诱导HA-S1P1(WT)内化,但不能诱导HA-S1P1(R142N)内化.提示FTY720诱导S1P1内化与ERY保守基序有关.
1형1-린산초안순수체(S1P1)시림파세포표면적중요수체.위연구S1P1중ERY보수기서여FTY720유도기내화적관계.이HA-S1P1-Myc-EGFP-N1위모판,응용중첩PCR적방법,장S1P1제142위적Arg(R)돌변위Asn(N),련동N단HA표첨일기,극륭입pcDNA3.1(+)진핵표체재체.동시PCR확증야생형S1P1,극륭인pcDNA3·1(+)중.한제성매절소화、PCR화측서감정후,경Polyfect전염입HEK293세포.G418사선출은정세포주.100 nmol/LFTY720처리12 h후,항HA-PE항체염색,용류식세포의검측S1P1재HEK293세포상적표체정황.결과현시HA-S1P1(WT)-pcDNA3.1(+)화HA-S1P1(R142N)-pcDNA3.1(+)재체피성공구건,HA-S1P1(WT)화HA-S1P1(R142N)단백표체재HEK293은정세포주적표면.FTY720능유도HA-S1P1(WT)내화,단불능유도HA-S1P1(R142N)내화.제시FTY720유도S1P1내화여ERY보수기서유관.