徐州医学院学报
徐州醫學院學報
서주의학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE XUZHOU
2011年
5期
300-305
,共6页
汪六庆%胡元生%沈继龙%刘宜升
汪六慶%鬍元生%瀋繼龍%劉宜升
왕륙경%호원생%침계룡%류의승
人肠道病毒71型%外壳蛋白1%卵黄抗体%IgY
人腸道病毒71型%外殼蛋白1%卵黃抗體%IgY
인장도병독71형%외각단백1%란황항체%IgY
目的 克隆肠道病毒71型(EV71)BrCr株外壳蛋白1(VP1)基因,构建原核表达载体PET28a/VP1,表达VP1重组蛋白,以VP1免疫产蛋母鸡,获得抗VP1的鸡免疫球蛋白(IgY).方法 培养Vero细胞,利用Vero细胞增殖肠道病毒EV71 BrCr株,提取病毒总RNA,利用RT-PCR扩增出VP1目的基因,目的基因插入克隆载体pGEM-T,提取重组质粒,经BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切获得目的基因,插入原核表达载体pET-28a,重组子同时BamHⅠ,EcoRⅠ双酶切和测序鉴定,转化入感受态工程菌E.coli BL21(DE3),获得阳性重组工程菌,经IPTG诱导获得表达融合蛋白,试剂盒纯化蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,用VP1蛋白免疫开产母鸡,收集鸡蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System试剂盒提取卵黄抗体IgY,间接ELISA测滴度,SDS-PAGE和Western blotting验证其表达量和免疫活性.结果 本实验成功扩增出肠道病毒EV71 BrCr株VP1基因,获得了含重组表达质粒pET28a/VP1的阳性工程菌株,经IPTG诱导能高效表达VP1蛋白,VP1经SDS-PAGE和Western blotting鉴定后,利用纯化后VP1蛋白免疫产蛋母鸡,提取的IgY经ELISA 鉴定后其滴度为1:104,SDS-PAGE和Western blotting证实为抗VP1的特异性IgY.结论 成功的从EV71 BrCr株扩增出VP1基因,构建了PET28a/VP1表达载体,获得高效表达融合蛋白,免疫产蛋母鸡后制备高效价抗VP1蛋白的特异性IgY.
目的 剋隆腸道病毒71型(EV71)BrCr株外殼蛋白1(VP1)基因,構建原覈錶達載體PET28a/VP1,錶達VP1重組蛋白,以VP1免疫產蛋母鷄,穫得抗VP1的鷄免疫毬蛋白(IgY).方法 培養Vero細胞,利用Vero細胞增殖腸道病毒EV71 BrCr株,提取病毒總RNA,利用RT-PCR擴增齣VP1目的基因,目的基因插入剋隆載體pGEM-T,提取重組質粒,經BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切穫得目的基因,插入原覈錶達載體pET-28a,重組子同時BamHⅠ,EcoRⅠ雙酶切和測序鑒定,轉化入感受態工程菌E.coli BL21(DE3),穫得暘性重組工程菌,經IPTG誘導穫得錶達融閤蛋白,試劑盒純化蛋白,經SDS-PAGE和Western blotting鑒定後,用VP1蛋白免疫開產母鷄,收集鷄蛋,利用EGG stractTM IgY Purification System試劑盒提取卵黃抗體IgY,間接ELISA測滴度,SDS-PAGE和Western blotting驗證其錶達量和免疫活性.結果 本實驗成功擴增齣腸道病毒EV71 BrCr株VP1基因,穫得瞭含重組錶達質粒pET28a/VP1的暘性工程菌株,經IPTG誘導能高效錶達VP1蛋白,VP1經SDS-PAGE和Western blotting鑒定後,利用純化後VP1蛋白免疫產蛋母鷄,提取的IgY經ELISA 鑒定後其滴度為1:104,SDS-PAGE和Western blotting證實為抗VP1的特異性IgY.結論 成功的從EV71 BrCr株擴增齣VP1基因,構建瞭PET28a/VP1錶達載體,穫得高效錶達融閤蛋白,免疫產蛋母鷄後製備高效價抗VP1蛋白的特異性IgY.
목적 극륭장도병독71형(EV71)BrCr주외각단백1(VP1)기인,구건원핵표체재체PET28a/VP1,표체VP1중조단백,이VP1면역산단모계,획득항VP1적계면역구단백(IgY).방법 배양Vero세포,이용Vero세포증식장도병독EV71 BrCr주,제취병독총RNA,이용RT-PCR확증출VP1목적기인,목적기인삽입극륭재체pGEM-T,제취중조질립,경BamHⅠ、EcoRⅠ쌍매절획득목적기인,삽입원핵표체재체pET-28a,중조자동시BamHⅠ,EcoRⅠ쌍매절화측서감정,전화입감수태공정균E.coli BL21(DE3),획득양성중조공정균,경IPTG유도획득표체융합단백,시제합순화단백,경SDS-PAGE화Western blotting감정후,용VP1단백면역개산모계,수집계단,이용EGG stractTM IgY Purification System시제합제취란황항체IgY,간접ELISA측적도,SDS-PAGE화Western blotting험증기표체량화면역활성.결과 본실험성공확증출장도병독EV71 BrCr주VP1기인,획득료함중조표체질립pET28a/VP1적양성공정균주,경IPTG유도능고효표체VP1단백,VP1경SDS-PAGE화Western blotting감정후,이용순화후VP1단백면역산단모계,제취적IgY경ELISA 감정후기적도위1:104,SDS-PAGE화Western blotting증실위항VP1적특이성IgY.결론 성공적종EV71 BrCr주확증출VP1기인,구건료PET28a/VP1표체재체,획득고효표체융합단백,면역산단모계후제비고효개항VP1단백적특이성IgY.
