蚕业科学
蠶業科學
잠업과학
ACTA SERICOLOGICA SINICA
2011年
2期
238-245
,共8页
舒建洪%梁莉惠%郑青亮%牛伟涛%张耀洲
舒建洪%樑莉惠%鄭青亮%牛偉濤%張耀洲
서건홍%량리혜%정청량%우위도%장요주
家蚕%CHCH保守结构域%基因克隆%荧光定量PCR%Western blotting分析%细胞定位
傢蠶%CHCH保守結構域%基因剋隆%熒光定量PCR%Western blotting分析%細胞定位
가잠%CHCH보수결구역%기인극륭%형광정량PCR%Western blotting분석%세포정위
含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能.从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1).该序列开放阅读框大小为435bp,编码144个氨基酸残基.将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.通过Western blotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达.利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中.初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程.
含有CHCH保守結構域的蛋白在不同物種中行使不同的功能.從傢蠶蛹cDNA文庫篩選穫得一條cDNA序列,經生物信息學分析髮現其編碼蛋白含有一箇CHCH保守結構域,將該基因命名為BmCH(GenBank登錄號:DQ443425.1).該序列開放閱讀框大小為435bp,編碼144箇氨基痠殘基.將成功構建的重組質粒pET-28a(+)-BmCH轉化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,經IPTG誘導錶達BmCH融閤蛋白,用親和層析進行純化後,將融閤蛋白免疫新西蘭大白兔製備多剋隆抗體.通過Western blotting檢測BmCH在傢蠶4箇髮育時期和5齡幼蟲組織中的錶達情況與用熒光定量PCR檢測BmCH在傢蠶不同髮育時期及5齡幼蟲組織中的轉錄結果基本一緻:該蛋白在卵、幼蟲、蛹、蛾4箇髮育時期均有錶達,其中在5齡幼蟲期的錶達量最高;該蛋白在5齡幼蟲的錶皮、精巢、中腸、絲腺和卵巢中有明顯錶達,在血淋巴、馬氏管、脂肪體中的錶達量較少,但差異不大,而在氣管和頭部沒有錶達.利用抗體的免疫熒光標記對BmCH在傢蠶BmN細胞中的定位進行研究,觀察到該蛋白主要分佈在細胞質中.初步推測BmCH可能是傢蠶生長髮育的必需蛋白,參與多種細胞生命活動的過程.
함유CHCH보수결구역적단백재불동물충중행사불동적공능.종가잠용cDNA문고사선획득일조cDNA서렬,경생물신식학분석발현기편마단백함유일개CHCH보수결구역,장해기인명명위BmCH(GenBank등록호:DQ443425.1).해서렬개방열독광대소위435bp,편마144개안기산잔기.장성공구건적중조질립pET-28a(+)-BmCH전화도E.coli Rosetta(DE3)균주,경IPTG유도표체BmCH융합단백,용친화층석진행순화후,장융합단백면역신서란대백토제비다극륭항체.통과Western blotting검측BmCH재가잠4개발육시기화5령유충조직중적표체정황여용형광정량PCR검측BmCH재가잠불동발육시기급5령유충조직중적전록결과기본일치:해단백재란、유충、용、아4개발육시기균유표체,기중재5령유충기적표체량최고;해단백재5령유충적표피、정소、중장、사선화란소중유명현표체,재혈림파、마씨관、지방체중적표체량교소,단차이불대,이재기관화두부몰유표체.이용항체적면역형광표기대BmCH재가잠BmN세포중적정위진행연구,관찰도해단백주요분포재세포질중.초보추측BmCH가능시가잠생장발육적필수단백,삼여다충세포생명활동적과정.
