医学分子生物学杂志
醫學分子生物學雜誌
의학분자생물학잡지
FOREIGN MEDICAL SCIENCES
2011年
6期
494-500
,共7页
刘照亮%王彪%郭国祥%单秀英%王美水%庄福连%蔡传书%张明凤%张彦定
劉照亮%王彪%郭國祥%單秀英%王美水%莊福連%蔡傳書%張明鳳%張彥定
류조량%왕표%곽국상%단수영%왕미수%장복련%채전서%장명봉%장언정
RNA干扰%Ang2%慢病毒载体%恶性黑色素瘤
RNA榦擾%Ang2%慢病毒載體%噁性黑色素瘤
RNA간우%Ang2%만병독재체%악성흑색소류
目的 构建携带促血管生成素2-小干扰RNA(Ang2-siRNA)慢病毒载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因表达的干扰作用.方法 将经XbaⅠ酶切电泳鉴定的带有加强绿色荧光蛋白的转移质粒(pNL-EGFP)载体与pSilencer 1.0-U6启动子-促血管生成素2-小干扰RNA(pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA)重组质粒连接,产生加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅰ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ)、加强绿色荧光蛋白的转移质粒-U6启动子-促血管生成素2-Ⅱ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ)慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性克隆,测序鉴定.用连接成功的慢病毒转移质粒、水疱性口炎病毒G蛋白(pVSVG)包膜质粒和pHelper包装质粒共转染293T细胞,产生pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,测定病毒滴度.将收集的病毒上清感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR测定抑制Ang2基因表达的效率.结果 酶切电泳与测序鉴定证实成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,293T细胞测定病毒原液滴度为8.0×103/ml.实时荧光定量RT-PCR结果显示:Ang2-siRNA慢病毒载体感染恶性黑色素瘤细胞,抑制了恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达(P＜0.05).结论 成功构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,体外研究显示Ang2-SiRNA慢病毒载体能抑制恶性黑色素瘤细胞中Ang2 mRNA的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的干预实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据.
目的 構建攜帶促血管生成素2-小榦擾RNA(Ang2-siRNA)慢病毒載體,觀察其對噁性黑色素瘤細胞中Ang2基因錶達的榦擾作用.方法 將經XbaⅠ酶切電泳鑒定的帶有加彊綠色熒光蛋白的轉移質粒(pNL-EGFP)載體與pSilencer 1.0-U6啟動子-促血管生成素2-小榦擾RNA(pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA)重組質粒連接,產生加彊綠色熒光蛋白的轉移質粒-U6啟動子-促血管生成素2-Ⅰ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ)、加彊綠色熒光蛋白的轉移質粒-U6啟動子-促血管生成素2-Ⅱ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ)慢病毒轉移質粒,電泳篩選暘性剋隆,測序鑒定.用連接成功的慢病毒轉移質粒、水皰性口炎病毒G蛋白(pVSVG)包膜質粒和pHelper包裝質粒共轉染293T細胞,產生pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒.收集病毒上清,測定病毒滴度.將收集的病毒上清感染噁性黑色素瘤細胞,通過實時熒光定量RT-PCR測定抑製Ang2基因錶達的效率.結果 酶切電泳與測序鑒定證實成功構建瞭Ang2-SiRNA慢病毒載體,293T細胞測定病毒原液滴度為8.0×103/ml.實時熒光定量RT-PCR結果顯示:Ang2-siRNA慢病毒載體感染噁性黑色素瘤細胞,抑製瞭噁性黑色素瘤細胞中Ang2基因的錶達(P＜0.05).結論 成功構建瞭Ang2-SiRNA慢病毒載體,體外研究顯示Ang2-SiRNA慢病毒載體能抑製噁性黑色素瘤細胞中Ang2 mRNA的錶達,為下一步進行裸鼠噁性黑色素瘤移植瘤生長的榦預實驗奠定基礎,為腫瘤的基因治療提供實驗依據.
목적 구건휴대촉혈관생성소2-소간우RNA(Ang2-siRNA)만병독재체,관찰기대악성흑색소류세포중Ang2기인표체적간우작용.방법 장경XbaⅠ매절전영감정적대유가강록색형광단백적전이질립(pNL-EGFP)재체여pSilencer 1.0-U6계동자-촉혈관생성소2-소간우RNA(pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA)중조질립련접,산생가강록색형광단백적전이질립-U6계동자-촉혈관생성소2-Ⅰ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ)、가강록색형광단백적전이질립-U6계동자-촉혈관생성소2-Ⅱ(pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ)만병독전이질립,전영사선양성극륭,측서감정.용련접성공적만병독전이질립、수포성구염병독G단백(pVSVG)포막질립화pHelper포장질립공전염293T세포,산생pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ만병독.수집병독상청,측정병독적도.장수집적병독상청감염악성흑색소류세포,통과실시형광정량RT-PCR측정억제Ang2기인표체적효솔.결과 매절전영여측서감정증실성공구건료Ang2-SiRNA만병독재체,293T세포측정병독원액적도위8.0×103/ml.실시형광정량RT-PCR결과현시:Ang2-siRNA만병독재체감염악성흑색소류세포,억제료악성흑색소류세포중Ang2기인적표체(P＜0.05).결론 성공구건료Ang2-SiRNA만병독재체,체외연구현시Ang2-SiRNA만병독재체능억제악성흑색소류세포중Ang2 mRNA적표체,위하일보진행라서악성흑색소류이식류생장적간예실험전정기출,위종류적기인치료제공실험의거.
