第三军医大学学报
第三軍醫大學學報
제삼군의대학학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE MILITARIS TERTIAE
2008年
10期
885-889
,共5页
刘勤%张晋宇%王露露%刘昌峨%王勇%万瑛
劉勤%張晉宇%王露露%劉昌峨%王勇%萬瑛
류근%장진우%왕로로%류창아%왕용%만영
慢病毒载体%增强型绿色荧光蛋白%转基因小鼠
慢病毒載體%增彊型綠色熒光蛋白%轉基因小鼠
만병독재체%증강형록색형광단백%전기인소서
目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.
目的 以慢病毒作為載體,製作增彊型綠色熒光蛋白(EGFP)轉基因小鼠,建立慢病毒介導的轉基因動物製備技術平檯.方法 慢病毒包裝採用三質粒繫統.3箇質粒分彆為轉基因質粒FUGW、病毒結構蛋白錶達質粒psPAX2以及病毒包膜蛋白錶達質粒pMD2.G.病毒包裝時,用燐痠鈣沉澱法將三質粒共轉染來源于人胚腎細胞繫的293FT細胞,培養48 h後,收取含病毒的上清,併通過高速離心濃縮病毒.將含濃縮病毒液作梯度稀釋後感染293FT細胞,通過流式細胞計數儀測定病毒滴度.用顯微註射法將濃縮的病毒液註射至FVB/N小鼠1-細胞期胚胎透明帶下.在熒光顯微鏡下觀察胚胎EGFP的錶達.將註射後髮育至2-細胞期的胚胎移植至假孕受體母鼠,得F0代小鼠.通過紫外光照射觀測EGFP在小鼠活體內的錶達水平.結果 病毒液濃縮前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),經過高速離心對病毒進行濃縮和純化,其滴度達到109 TU/ml以上.將濃縮病毒液註射至小鼠1-細胞期胚胎透明帶下,註射後胚胎的2-細胞期卵裂率為81.8%(1 189/1 453),利用熒光顯微鏡分彆在註射後60、84、132 h觀察胚胎,均髮現有較彊熒光.在2-細胞期,每一視野下胚胎暘性率＞90%,說明包裝的病毒成功併高效地轉染小鼠胚胎.胚胎移植後假孕母鼠妊娠率為42.9%(12/28),首建鼠暘性率為60.8%(73/120),轉基因小鼠的總體研製效率(轉基因小鼠數/註射胚胎數)為5.0%(73/1 453).將F0代EGFP轉基因小鼠分彆與野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均穫得瞭EGFP暘性小鼠,暘性率分彆為91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).結論 通過慢病毒載體感染小鼠1-細胞期胚胎可有效地製備轉基因小鼠.我們已初步建立瞭慢病毒介導的轉基因小鼠製備技術體繫.
목적 이만병독작위재체,제작증강형록색형광단백(EGFP)전기인소서,건립만병독개도적전기인동물제비기술평태.방법 만병독포장채용삼질립계통.3개질립분별위전기인질립FUGW、병독결구단백표체질립psPAX2이급병독포막단백표체질립pMD2.G.병독포장시,용린산개침정법장삼질립공전염래원우인배신세포계적293FT세포,배양48 h후,수취함병독적상청,병통과고속리심농축병독.장함농축병독액작제도희석후감염293FT세포,통과류식세포계수의측정병독적도.용현미주사법장농축적병독액주사지FVB/N소서1-세포기배태투명대하.재형광현미경하관찰배태EGFP적표체.장주사후발육지2-세포기적배태이식지가잉수체모서,득F0대소서.통과자외광조사관측EGFP재소서활체내적표체수평.결과 병독액농축전적적도≥106 TU/ml(transducing unit,TU),경과고속리심대병독진행농축화순화,기적도체도109 TU/ml이상.장농축병독액주사지소서1-세포기배태투명대하,주사후배태적2-세포기란렬솔위81.8%(1 189/1 453),이용형광현미경분별재주사후60、84、132 h관찰배태,균발현유교강형광.재2-세포기,매일시야하배태양성솔＞90%,설명포장적병독성공병고효지전염소서배태.배태이식후가잉모서임신솔위42.9%(12/28),수건서양성솔위60.8%(73/120),전기인소서적총체연제효솔(전기인소서수/주사배태수)위5.0%(73/1 453).장F0대EGFP전기인소서분별여야생형소서교배,재기F1、F2、F3대소서중균획득료EGFP양성소서,양성솔분별위91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).결론 통과만병독재체감염소서1-세포기배태가유효지제비전기인소서.아문이초보건립료만병독개도적전기인소서제비기술체계.
