心血管康复医学杂志
心血管康複醫學雜誌
심혈관강복의학잡지
JOURNAL OF CARDIOVASCULAR REHABILITATION MEDICINE
2010年
1期
10-14,封3
,共6页
基因%克隆细胞%基因,病毒
基因%剋隆細胞%基因,病毒
기인%극륭세포%기인,병독
目的:本研究以构建存活素-增强型绿色荧光蛋白(Survivin ＆ eGFP)融合基因慢病毒表达载体(p-GCFU-Survivin)为例来探讨In-Fusion克隆技术在常规载体构建中的应用价值.方法:根据In-Fusion技术原理,克隆引物设计时,在Survivin同源序列的两侧分别引入经Age I线性化的载体p-GCFU两端各15个碱基,将以此引物扩增的聚合酶链式反应(PCR)产物与线性化p-GCFU用In-Fusion交换酶在室温下作用30min,使Survivin特异性扩增产物两端的序列与线性化载体两端的序列发生同源交换,取2μl交换液进行转化,挑取阳性克隆,进行酶切和测序鉴定.将鉴定正确的阳性克隆瞬时转染293T细胞,观察Survivin ＆ eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达.结果:每2μl克隆交换液获得大约103个克隆数,阳性率达90%以上,瞬时转染p-GCFU-Survivin可获得Survivin ＆ eGFP融合蛋白在293T细胞中的表达.结论:该技术是一种非连接酶依赖性克隆技术,使基因克隆步骤简化并大大节省了实验时间和经费.
目的:本研究以構建存活素-增彊型綠色熒光蛋白(Survivin ＆ eGFP)融閤基因慢病毒錶達載體(p-GCFU-Survivin)為例來探討In-Fusion剋隆技術在常規載體構建中的應用價值.方法:根據In-Fusion技術原理,剋隆引物設計時,在Survivin同源序列的兩側分彆引入經Age I線性化的載體p-GCFU兩耑各15箇堿基,將以此引物擴增的聚閤酶鏈式反應(PCR)產物與線性化p-GCFU用In-Fusion交換酶在室溫下作用30min,使Survivin特異性擴增產物兩耑的序列與線性化載體兩耑的序列髮生同源交換,取2μl交換液進行轉化,挑取暘性剋隆,進行酶切和測序鑒定.將鑒定正確的暘性剋隆瞬時轉染293T細胞,觀察Survivin ＆ eGFP融閤蛋白在293T細胞中的錶達.結果:每2μl剋隆交換液穫得大約103箇剋隆數,暘性率達90%以上,瞬時轉染p-GCFU-Survivin可穫得Survivin ＆ eGFP融閤蛋白在293T細胞中的錶達.結論:該技術是一種非連接酶依賴性剋隆技術,使基因剋隆步驟簡化併大大節省瞭實驗時間和經費.
목적:본연구이구건존활소-증강형록색형광단백(Survivin ＆ eGFP)융합기인만병독표체재체(p-GCFU-Survivin)위례래탐토In-Fusion극륭기술재상규재체구건중적응용개치.방법:근거In-Fusion기술원리,극륭인물설계시,재Survivin동원서렬적량측분별인입경Age I선성화적재체p-GCFU량단각15개감기,장이차인물확증적취합매련식반응(PCR)산물여선성화p-GCFU용In-Fusion교환매재실온하작용30min,사Survivin특이성확증산물량단적서렬여선성화재체량단적서렬발생동원교환,취2μl교환액진행전화,도취양성극륭,진행매절화측서감정.장감정정학적양성극륭순시전염293T세포,관찰Survivin ＆ eGFP융합단백재293T세포중적표체.결과:매2μl극륭교환액획득대약103개극륭수,양성솔체90%이상,순시전염p-GCFU-Survivin가획득Survivin ＆ eGFP융합단백재293T세포중적표체.결론:해기술시일충비련접매의뢰성극륭기술,사기인극륭보취간화병대대절성료실험시간화경비.
