中华神经外科疾病研究杂志
中華神經外科疾病研究雜誌
중화신경외과질병연구잡지
CHINESE JOURNAL OF NEUROSURGICAL DISEASE RESEARCH
2004年
5期
441-444
,共4页
黄安炀%章翔%陈长春%李霞%刘新平
黃安煬%章翔%陳長春%李霞%劉新平
황안양%장상%진장춘%리하%류신평
PTEN%基因克隆%真核表达载体
PTEN%基因剋隆%真覈錶達載體
PTEN%기인극륭%진핵표체재체
目的亚克隆野生型与张力蛋白在10号染色体同源缺失的磷酸酶(PTEN)基因,构建四环素反应性元件调控的与张力蛋白在10号染色体同源缺失的磷酸酶反应质粒(pTRE-PTEN).方法以pBP-PTEN质粒为模板, 应用pfuDNA聚合酶,多聚酶链反应法(PCR)扩增PTENcDNA.将扩增的PTENcDNA与三磷酸脱氧腺苷(dATP)反应,然后将产物与pGEM-T-Easy载体直接连接;连接产物转化大肠杆菌DH5 α,蓝白筛选,挑选白色克隆作鉴定测序.将测序正确的pGEM-T-Easy/PTEN和带潮霉素筛选标记的四环素反应性元件质粒(pTRE2Hyg)分别双酶切,前者回收1.2 kb的PTEN片段,后者回收线性化的pTRE2Hyg片段,将两者连接成pTRE-PTEN表达重组体,转化大肠杆菌DH5α,抽提重组体质粒,经NotⅠ和SalⅠ酶切鉴定阳性克隆含有大小约6.4 kb和1.2 kb的两条带.结果成功地从pBP-PTEN质粒中亚克隆人PTENcDNA,并构建了pTRE-PTEN反应质粒.结论 pTRE-PTEN反应质粒的构建为建立pTet-on-PTEN-U87MG细胞系奠定基础.
目的亞剋隆野生型與張力蛋白在10號染色體同源缺失的燐痠酶(PTEN)基因,構建四環素反應性元件調控的與張力蛋白在10號染色體同源缺失的燐痠酶反應質粒(pTRE-PTEN).方法以pBP-PTEN質粒為模闆, 應用pfuDNA聚閤酶,多聚酶鏈反應法(PCR)擴增PTENcDNA.將擴增的PTENcDNA與三燐痠脫氧腺苷(dATP)反應,然後將產物與pGEM-T-Easy載體直接連接;連接產物轉化大腸桿菌DH5 α,藍白篩選,挑選白色剋隆作鑒定測序.將測序正確的pGEM-T-Easy/PTEN和帶潮黴素篩選標記的四環素反應性元件質粒(pTRE2Hyg)分彆雙酶切,前者迴收1.2 kb的PTEN片段,後者迴收線性化的pTRE2Hyg片段,將兩者連接成pTRE-PTEN錶達重組體,轉化大腸桿菌DH5α,抽提重組體質粒,經NotⅠ和SalⅠ酶切鑒定暘性剋隆含有大小約6.4 kb和1.2 kb的兩條帶.結果成功地從pBP-PTEN質粒中亞剋隆人PTENcDNA,併構建瞭pTRE-PTEN反應質粒.結論 pTRE-PTEN反應質粒的構建為建立pTet-on-PTEN-U87MG細胞繫奠定基礎.
목적아극륭야생형여장력단백재10호염색체동원결실적린산매(PTEN)기인,구건사배소반응성원건조공적여장력단백재10호염색체동원결실적린산매반응질립(pTRE-PTEN).방법이pBP-PTEN질립위모판, 응용pfuDNA취합매,다취매련반응법(PCR)확증PTENcDNA.장확증적PTENcDNA여삼린산탈양선감(dATP)반응,연후장산물여pGEM-T-Easy재체직접련접;련접산물전화대장간균DH5 α,람백사선,도선백색극륭작감정측서.장측서정학적pGEM-T-Easy/PTEN화대조매소사선표기적사배소반응성원건질립(pTRE2Hyg)분별쌍매절,전자회수1.2 kb적PTEN편단,후자회수선성화적pTRE2Hyg편단,장량자련접성pTRE-PTEN표체중조체,전화대장간균DH5α,추제중조체질립,경NotⅠ화SalⅠ매절감정양성극륭함유대소약6.4 kb화1.2 kb적량조대.결과성공지종pBP-PTEN질립중아극륭인PTENcDNA,병구건료pTRE-PTEN반응질립.결론 pTRE-PTEN반응질립적구건위건립pTet-on-PTEN-U87MG세포계전정기출.
