CAJ | 학술논문

目的采用RNA干扰技术抑制培养大鼠心肌细胞α烯醇化酶的表达,探讨α烯醇化酶对心肌细胞能量产生和收缩功能的影响.方法针对α烯醇化酶基因,化学合成3对小片段干扰RNA(siRNA)(分别为针对α烯醇化酶mRNA 406～425位点的序列1,针对α烯醇化酶mRNA 656～675位点的序列2及针对α烯醇化酶mRNA754～773位点的序列3)并转染原代培养的WKY大鼠心肌细胞.采用Real-time RT-PCR和Western blot技术分别在mRNA和蛋白水平检测α烯醇化酶的表达情况,筛选其中沉默效应最好的序列(序列1)转染心肌细胞,即RNA干扰实验组,以未转染siRNA的心肌细胞为对照组,荧光素荧光素酶法检测细胞ATP水平,视频跟踪计算机测定系统测定细胞收缩反应,参数包括最大收缩幅度(dL),最大收缩速度(dL/dtmax).结果针对α烯醇化酶mR-NA 406～425位点的siRNA显著下调α烯醇化酶mRNA和蛋白的表达,并且呈剂量和时间依赖关系,200 nmol/L可达到最大沉默效应,其下调α烯醇化酶mRNA和蛋白表达的最大效应分别出现在转染后24 h和48 h.α烯醇化酶沉默后细胞ATP产生减少(3.55×10-7 nmol/mg蛋白),dL[(0.82±0.02)μm]和dL/dtmax[(2.7±0.3)μm/s]下降.结论应用siRNA技术靶向α烯醇化酶mRNA 406～425位点可有效下调心肌细胞α烯醇化酶的表达,使细胞产能减少,收缩功能下降.
목적 채용RNA간우기술억제배양대서심기세포α희순화매적표체,탐토α희순화매대심기세포능양산생화수축공능적영향.방법 침대α희순화매기인,화학합성3대소편단간우RNA(siRNA)(분별위침대α희순화매mRNA 406～425위점적서렬1,침대α희순화매mRNA 656～675위점적서렬2급침대α희순화매mRNA754～773위점적서렬3)병전염원대배양적WKY대서심기세포.채용Real-time RT-PCR화Western blot기술분별재mRNA화단백수평검측α희순화매적표체정황,사선기중침묵효응최호적서렬(서렬1)전염심기세포,즉RNA간우실험조,이미전염siRNA적심기세포위대조조,형광소형광소매법검측세포ATP수평,시빈근종계산궤측정계통측정세포수축반응,삼수포괄최대수축폭도(dL),최대수축속도(dL/dtmax).결과 침대α희순화매mR-NA 406～425위점적siRNA현저하조α희순화매mRNA화단백적표체,병차정제량화시간의뢰관계,200 nmol/L가체도최대침묵효응,기하조α희순화매mRNA화단백표체적최대효응분별출현재전염후24 h화48 h.α희순화매침묵후세포ATP산생감소(3.55×10-7 nmol/mg단백),dL[(0.82±0.02)μm]화dL/dtmax[(2.7±0.3)μm/s]하강.결론 응용siRNA기술파향α희순화매mRNA 406～425위점가유효하조심기세포α희순화매적표체,사세포산능감소,수축공능하강.