中国科学C辑
中國科學C輯
중국과학C집
SCIENCE IN CHINA (SERIES C)
2001年
3期
220-229
,共10页
梁铁兵%谭克辉%种康%朱至清%S.Pongor%A.Simoncsits
樑鐵兵%譚剋輝%種康%硃至清%S.Pongor%A.Simoncsits
량철병%담극휘%충강%주지청%S.Pongor%A.Simoncsits
结合位点筛选%434噬菌体阻遏蛋白%单链阻遏蛋白%DNA-蛋白质相互作用
結閤位點篩選%434噬菌體阻遏蛋白%單鏈阻遏蛋白%DNA-蛋白質相互作用
결합위점사선%434서균체조알단백%단련조알단백%DNA-단백질상호작용
单链阻遏蛋白RRTRES是噬菌体434阻遏蛋白的衍生物, 含有两个DBD(DNA结合结构域), 一个是野生型噬菌体434的 DBD-R, 另一个是突变型DBD-RTRES, 二者用重组接头以头接尾的方式连接起来. RTRES的a-3-螺旋中-1, 1, 2, 5 位DNA结合氨基酸分别为T, R, E, S. 利用核心序列是CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG的随机DNA库, 体外循环筛选RTRES的DNA结合位点, 将筛选到的群体克隆、测序. 单链阻遏蛋白 RRTRES的亲和力测定表明, 最适操纵区序列含有TTAC或 TTCC(上述画线部分)时, Kd值在10-12~10-11 mol/L的范围. 天然噬菌体434阻遏蛋白与其操纵区的亲和力的Kd值在10-9 mol/L数量级, 与之相比, 所筛选操纵区的亲和力明显提高. 同时发现, 亲和力大小还受到最适结合位点两侧碱基的影响, 特别是5′位碱基的影响. 根据RTRES的识别特性, 设计了共有序列为 GTAAGAAARNTTACN或GGAAGAAARNTTCCN (R为A或G)的单链阻遏蛋白RTRES RTRE的操纵区序列. 结果表明, 它们之间有特异性结合, 且亲和力也很高. 此方法可望用于其他DNA结合蛋白新的结合特异性的筛选.
單鏈阻遏蛋白RRTRES是噬菌體434阻遏蛋白的衍生物, 含有兩箇DBD(DNA結閤結構域), 一箇是野生型噬菌體434的 DBD-R, 另一箇是突變型DBD-RTRES, 二者用重組接頭以頭接尾的方式連接起來. RTRES的a-3-螺鏇中-1, 1, 2, 5 位DNA結閤氨基痠分彆為T, R, E, S. 利用覈心序列是CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG的隨機DNA庫, 體外循環篩選RTRES的DNA結閤位點, 將篩選到的群體剋隆、測序. 單鏈阻遏蛋白 RRTRES的親和力測定錶明, 最適操縱區序列含有TTAC或 TTCC(上述畫線部分)時, Kd值在10-12~10-11 mol/L的範圍. 天然噬菌體434阻遏蛋白與其操縱區的親和力的Kd值在10-9 mol/L數量級, 與之相比, 所篩選操縱區的親和力明顯提高. 同時髮現, 親和力大小還受到最適結閤位點兩側堿基的影響, 特彆是5′位堿基的影響. 根據RTRES的識彆特性, 設計瞭共有序列為 GTAAGAAARNTTACN或GGAAGAAARNTTCCN (R為A或G)的單鏈阻遏蛋白RTRES RTRE的操縱區序列. 結果錶明, 它們之間有特異性結閤, 且親和力也很高. 此方法可望用于其他DNA結閤蛋白新的結閤特異性的篩選.
단련조알단백RRTRES시서균체434조알단백적연생물, 함유량개DBD(DNA결합결구역), 일개시야생형서균체434적 DBD-R, 령일개시돌변형DBD-RTRES, 이자용중조접두이두접미적방식련접기래. RTRES적a-3-라선중-1, 1, 2, 5 위DNA결합안기산분별위T, R, E, S. 이용핵심서렬시CATACAAGAAAGNNNNNNTTTATG적수궤DNA고, 체외순배사선RTRES적DNA결합위점, 장사선도적군체극륭、측서. 단련조알단백 RRTRES적친화력측정표명, 최괄조종구서렬함유TTAC혹 TTCC(상술화선부분)시, Kd치재10-12~10-11 mol/L적범위. 천연서균체434조알단백여기조종구적친화력적Kd치재10-9 mol/L수량급, 여지상비, 소사선조종구적친화력명현제고. 동시발현, 친화력대소환수도최괄결합위점량측감기적영향, 특별시5′위감기적영향. 근거RTRES적식별특성, 설계료공유서렬위 GTAAGAAARNTTACN혹GGAAGAAARNTTCCN (R위A혹G)적단련조알단백RTRES RTRE적조종구서렬. 결과표명, 타문지간유특이성결합, 차친화력야흔고. 차방법가망용우기타DNA결합단백신적결합특이성적사선.
