CAJ | 학술논문

针对在低拷贝自杀质粒pCVD442中难以进行基因操作的缺陷,将Gateway技术应用在基因敲除前期的重组质粒构建过程.应用这一改进的系统构建了福氏2a志贺氏菌301株转铁相关基因sitC的插入突变体MTS.对突变体分别在培养基、细胞和动物实验水平进行了功能检测,并利用芯片技术进行了限铁条件下突变体和野生型菌株的表达谱比较.结果显示,在添150μmol/L铁螯合剂DIP(2,2'-dipyridyl)条件下,MTS生长水平明显低于野生株,补加铁离子或锰离子可使突变株生长回复到丰富培养基条件下的生长水平;在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖能力和胞间扩散能力以及豚鼠角膜结膜炎实验中,MTS没有显现出明显的毒力改变,但在HeLa细胞侵袭过程中添加65μmol/L的DIP, MTS的胞内存活增殖能力和Sf301相比下降了51.6%. 限铁条件下的表达谱结果表明,整体上MTS对缺铁变化比Sf301更敏感,上调的基因比野生株多106个,主要涉及膜转运、氨基酸代谢和功能未分类基因,而下调基因中参与能量代谢和碳水化合物代谢的较多.缺铁条件下,已知的转铁相关基因普遍上调,且MTS中上调的基因数目及上调幅度要高Sf301.此结果再次证实了Sit铁转运系统对志贺氏菌生长的重要性.
침대재저고패자살질립pCVD442중난이진행기인조작적결함,장Gateway기술응용재기인고제전기적중조질립구건과정.응용저일개진적계통구건료복씨2a지하씨균301주전철상관기인sitC적삽입돌변체MTS.대돌변체분별재배양기、세포화동물실험수평진행료공능검측,병이용심편기술진행료한철조건하돌변체화야생형균주적표체보비교.결과현시,재첨150μmol/L철오합제DIP(2,2'-dipyridyl)조건하,MTS생장수평명현저우야생주,보가철리자혹맹리자가사돌변주생장회복도봉부배양기조건하적생장수평;재HeLa세포화U937세포적포내존활증식능력화포간확산능력이급돈서각막결막염실험중,MTS몰유현현출명현적독력개변,단재HeLa세포침습과정중첨가65μmol/L적DIP, MTS적포내존활증식능력화Sf301상비하강료51.6%. 한철조건하적표체보결과표명,정체상MTS대결철변화비Sf301경민감,상조적기인비야생주다106개,주요섭급막전운、안기산대사화공능미분류기인,이하조기인중삼여능량대사화탄수화합물대사적교다.결철조건하,이지적전철상관기인보편상조,차MTS중상조적기인수목급상조폭도요고Sf301.차결과재차증실료Sit철전운계통대지하씨균생장적중요성.