中国兽医科学
中國獸醫科學
중국수의과학
VETERINARY SCIENCE IN CHINA
2006年
12期
1000-1004
,共5页
谢印乾%高云英%沈志强%朱和鸣%管宇%王茹%张锋钢
謝印乾%高雲英%瀋誌彊%硃和鳴%管宇%王茹%張鋒鋼
사인건%고운영%침지강%주화명%관우%왕여%장봉강
猪%IFN-γ基因%定量检测%RT-PCR
豬%IFN-γ基因%定量檢測%RT-PCR
저%IFN-γ기인%정량검측%RT-PCR
无菌分离的猪外周血单个核细胞(PBMC),经ConA体外刺激培养15 h后提取细胞总RNA.以此总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到了435 bp的IFN-γ基因.把扩增到的IFN-γ基因与pMD18-T载体连接,构建了pMD-IFN435重组质粒.用另一对引物对重组质粒pMD-IFN435内部进行PCR扩增,得到了257 bp(含PstⅠ酶切位点)的基因片段,将此基因片段连接到pMD18-T载体上构建了pMD-IFN257重组质粒.将pMD-IFN257双酶切(PstⅠ+SalⅠ)后回收的目的片段与pMD-IFN435双酶切(PstⅠ+SalⅠ)后回收的目的片段连接,得到了含有367bp目的片段的重组质粒pMD-IFN367,即内标准DNA模板.以定量后的pMD-IFN367与2倍梯度稀释的pMD-IFN435进行竞争PCR扩增,建立了能够准确、方便定量检测猪IFN-γmRNA的标准竞争曲线的线性回归方程(y=0.414x-1.864).
無菌分離的豬外週血單箇覈細胞(PBMC),經ConA體外刺激培養15 h後提取細胞總RNA.以此總RNA為模闆,採用RT-PCR技術擴增到瞭435 bp的IFN-γ基因.把擴增到的IFN-γ基因與pMD18-T載體連接,構建瞭pMD-IFN435重組質粒.用另一對引物對重組質粒pMD-IFN435內部進行PCR擴增,得到瞭257 bp(含PstⅠ酶切位點)的基因片段,將此基因片段連接到pMD18-T載體上構建瞭pMD-IFN257重組質粒.將pMD-IFN257雙酶切(PstⅠ+SalⅠ)後迴收的目的片段與pMD-IFN435雙酶切(PstⅠ+SalⅠ)後迴收的目的片段連接,得到瞭含有367bp目的片段的重組質粒pMD-IFN367,即內標準DNA模闆.以定量後的pMD-IFN367與2倍梯度稀釋的pMD-IFN435進行競爭PCR擴增,建立瞭能夠準確、方便定量檢測豬IFN-γmRNA的標準競爭麯線的線性迴歸方程(y=0.414x-1.864).
무균분리적저외주혈단개핵세포(PBMC),경ConA체외자격배양15 h후제취세포총RNA.이차총RNA위모판,채용RT-PCR기술확증도료435 bp적IFN-γ기인.파확증도적IFN-γ기인여pMD18-T재체련접,구건료pMD-IFN435중조질립.용령일대인물대중조질립pMD-IFN435내부진행PCR확증,득도료257 bp(함PstⅠ매절위점)적기인편단,장차기인편단련접도pMD18-T재체상구건료pMD-IFN257중조질립.장pMD-IFN257쌍매절(PstⅠ+SalⅠ)후회수적목적편단여pMD-IFN435쌍매절(PstⅠ+SalⅠ)후회수적목적편단련접,득도료함유367bp목적편단적중조질립pMD-IFN367,즉내표준DNA모판.이정량후적pMD-IFN367여2배제도희석적pMD-IFN435진행경쟁PCR확증,건립료능구준학、방편정량검측저IFN-γmRNA적표준경쟁곡선적선성회귀방정(y=0.414x-1.864).
