山东医药
山東醫藥
산동의약
SHANDONG MEDICAL JOURNAL
2012年
26期
10-13
,共4页
朱剑%许期年%王秀云%左剑玲%周岱%王中%伏林山%陈旭仁
硃劍%許期年%王秀雲%左劍玲%週岱%王中%伏林山%陳旭仁
주검%허기년%왕수운%좌검령%주대%왕중%복림산%진욱인
颅内肿瘤%胶质瘤%异柠檬酸脱氢酶1%双顺反子%质粒%基因突变
顱內腫瘤%膠質瘤%異檸檬痠脫氫酶1%雙順反子%質粒%基因突變
로내종류%효질류%이저몽산탈경매1%쌍순반자%질립%기인돌변
[目的]以pcDNA3.1(+)为骨架,构建并鉴定人脑胶质瘤组织中含R132H突变的人源异柠檬酸脱氢酶1基因(hIDHIR132H)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)序列的双顺反子真核表达载体.[方法]以内部核糖体进入位点(IRES)/EGFP片段为模板,扩增出IRES/EGFP片段,并在5′末端引入3×Flag标签；通过PCR介导的定点突变法,以pCMV-sports6-hIDH1为模板,扩增hIDH1R132H基因片段,并在3′末端引入3×Flag标签；通过PCR连接两种产物后经双酶切定向克隆入pcDNA3.1(+)骨架；转化大肠杆菌后挑取阳性克隆,提取质粒进行PCR检测及基因序列测定.[结果]PCR检测7个菌落中有6个阳性克隆,DNA测序发现引入了h1DH1基因.[结论]成功构建了双顺反子真核表达载体pcDNA3.1(+)-hIDH1 R132H/3 × Flag/IRES/EGFP,为研究人胶质瘤组织中R132H突变的作用机制奠定了基础.
[目的]以pcDNA3.1(+)為骨架,構建併鑒定人腦膠質瘤組織中含R132H突變的人源異檸檬痠脫氫酶1基因(hIDHIR132H)和增彊型綠色熒光蛋白(EGFP)序列的雙順反子真覈錶達載體.[方法]以內部覈糖體進入位點(IRES)/EGFP片段為模闆,擴增齣IRES/EGFP片段,併在5′末耑引入3×Flag標籤；通過PCR介導的定點突變法,以pCMV-sports6-hIDH1為模闆,擴增hIDH1R132H基因片段,併在3′末耑引入3×Flag標籤；通過PCR連接兩種產物後經雙酶切定嚮剋隆入pcDNA3.1(+)骨架；轉化大腸桿菌後挑取暘性剋隆,提取質粒進行PCR檢測及基因序列測定.[結果]PCR檢測7箇菌落中有6箇暘性剋隆,DNA測序髮現引入瞭h1DH1基因.[結論]成功構建瞭雙順反子真覈錶達載體pcDNA3.1(+)-hIDH1 R132H/3 × Flag/IRES/EGFP,為研究人膠質瘤組織中R132H突變的作用機製奠定瞭基礎.
[목적]이pcDNA3.1(+)위골가,구건병감정인뇌효질류조직중함R132H돌변적인원이저몽산탈경매1기인(hIDHIR132H)화증강형록색형광단백(EGFP)서렬적쌍순반자진핵표체재체.[방법]이내부핵당체진입위점(IRES)/EGFP편단위모판,확증출IRES/EGFP편단,병재5′말단인입3×Flag표첨；통과PCR개도적정점돌변법,이pCMV-sports6-hIDH1위모판,확증hIDH1R132H기인편단,병재3′말단인입3×Flag표첨；통과PCR련접량충산물후경쌍매절정향극륭입pcDNA3.1(+)골가；전화대장간균후도취양성극륭,제취질립진행PCR검측급기인서렬측정.[결과]PCR검측7개균락중유6개양성극륭,DNA측서발현인입료h1DH1기인.[결론]성공구건료쌍순반자진핵표체재체pcDNA3.1(+)-hIDH1 R132H/3 × Flag/IRES/EGFP,위연구인효질류조직중R132H돌변적작용궤제전정료기출.
