首都医科大学学报
首都醫科大學學報
수도의과대학학보
JOURNAL OF CAPITAL UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCES
2011年
3期
365-370
,共6页
袁艳鹏%关云谦%林庆玲%薛金花%蔡彦宁
袁豔鵬%關雲謙%林慶玲%薛金花%蔡彥寧
원염붕%관운겸%림경령%설금화%채언저
反转录巢式多重聚合酶链式反应%时钟基因%单细胞%NIH/3T3
反轉錄巢式多重聚閤酶鏈式反應%時鐘基因%單細胞%NIH/3T3
반전록소식다중취합매련식반응%시종기인%단세포%NIH/3T3
目的 建立一种高度灵敏的能够在单细胞水平检测时钟基因表达的反转录巢式多重聚合酶链式反应(multiplex nested reverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)体系.方法 选取核心时钟基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看家基因β-actin,分别设计和优化巢式引物对.以基因质粒为模板,检测巢式多重PCR体系的灵敏度.体外转录得到各个基因的RNA模板,并检测反转录巢式多重PCR体系的灵敏度.使用手动微操作器,显微镜下负压获取悬浮单个NIH/3T3细胞,使用反转录巢式多重PCR体系检测其中目的时钟基因.应用实时定量PCR检测整体水平时钟基因表达情况,与单细胞水平进行比较.结果 巢式多重PCR检测体系可以检测出单拷贝质粒DNA.反转录巢式多重PCR能够检测出4拷贝RNA模板.利用上述体系发现,NIH/3T3单细胞中时钟基因环路表达存在很大差异,同时发现群体水平per1和per2表达的高峰和低谷间差异有统计学意义,而单细胞水平per1表达则差异无统计学意义.结论 建立了高度灵敏的用于检测时钟基因表达的反转录巢式多重PCR体系,揭示了单细胞水平时钟基因表达的异质性,也验证了整体水平与单细胞水平时钟基因表达的差异.
目的 建立一種高度靈敏的能夠在單細胞水平檢測時鐘基因錶達的反轉錄巢式多重聚閤酶鏈式反應(multiplex nested reverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)體繫.方法 選取覈心時鐘基因bmal1,clock,per1,per2,cry1和cry2,以及看傢基因β-actin,分彆設計和優化巢式引物對.以基因質粒為模闆,檢測巢式多重PCR體繫的靈敏度.體外轉錄得到各箇基因的RNA模闆,併檢測反轉錄巢式多重PCR體繫的靈敏度.使用手動微操作器,顯微鏡下負壓穫取懸浮單箇NIH/3T3細胞,使用反轉錄巢式多重PCR體繫檢測其中目的時鐘基因.應用實時定量PCR檢測整體水平時鐘基因錶達情況,與單細胞水平進行比較.結果 巢式多重PCR檢測體繫可以檢測齣單拷貝質粒DNA.反轉錄巢式多重PCR能夠檢測齣4拷貝RNA模闆.利用上述體繫髮現,NIH/3T3單細胞中時鐘基因環路錶達存在很大差異,同時髮現群體水平per1和per2錶達的高峰和低穀間差異有統計學意義,而單細胞水平per1錶達則差異無統計學意義.結論 建立瞭高度靈敏的用于檢測時鐘基因錶達的反轉錄巢式多重PCR體繫,揭示瞭單細胞水平時鐘基因錶達的異質性,也驗證瞭整體水平與單細胞水平時鐘基因錶達的差異.
목적 건립일충고도령민적능구재단세포수평검측시종기인표체적반전록소식다중취합매련식반응(multiplex nested reverse transcription-polymerase chain reaction,multiplex nested RT-PCR)체계.방법 선취핵심시종기인bmal1,clock,per1,per2,cry1화cry2,이급간가기인β-actin,분별설계화우화소식인물대.이기인질립위모판,검측소식다중PCR체계적령민도.체외전록득도각개기인적RNA모판,병검측반전록소식다중PCR체계적령민도.사용수동미조작기,현미경하부압획취현부단개NIH/3T3세포,사용반전록소식다중PCR체계검측기중목적시종기인.응용실시정량PCR검측정체수평시종기인표체정황,여단세포수평진행비교.결과 소식다중PCR검측체계가이검측출단고패질립DNA.반전록소식다중PCR능구검측출4고패RNA모판.이용상술체계발현,NIH/3T3단세포중시종기인배로표체존재흔대차이,동시발현군체수평per1화per2표체적고봉화저곡간차이유통계학의의,이단세포수평per1표체칙차이무통계학의의.결론 건립료고도령민적용우검측시종기인표체적반전록소식다중PCR체계,게시료단세포수평시종기인표체적이질성,야험증료정체수평여단세포수평시종기인표체적차이.
