西安交通大学学报（医学版）
西安交通大學學報（醫學版）
서안교통대학학보（의학판）
JOURNAL OF XI'AN JIAOTONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCES)
2006年
5期
421-425
,共5页
潘巍巍%赖国旗%易发平%成海恩%张溢%左国伟%李成华%马永平%宋方洲
潘巍巍%賴國旂%易髮平%成海恩%張溢%左國偉%李成華%馬永平%宋方洲
반외외%뢰국기%역발평%성해은%장일%좌국위%리성화%마영평%송방주
人乳头瘤病毒%腺病毒%角蛋白启动子
人乳頭瘤病毒%腺病毒%角蛋白啟動子
인유두류병독%선병독%각단백계동자
目的 利用AdEasy系统构建携带人角蛋白启动子的人乳头瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重组腺病毒,并通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达.方法 应用PCR方法从含有HPV-16全基因序列的质粒上扩增E6/E7基因,构建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA载体,扩增、酶切获得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭载体质粒pAdTrack上,构建重组穿梭载体pAdTrack-K14-E6/E7-polA,线性化后与骨架载体AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组得到腺病毒质粒pAd-K14-E6/E7-polA,经人胚肾293细胞包装后得到重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA.氢化铯(CsCl)梯度离心纯化病毒,提取病毒再感染后的293细胞总RNA,通过RT-PCR方法检测E6/E7基因的表达.结果 通过同源重组的方法构建了腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA载体,经酶切和测序鉴定该质粒构建成功.293细胞包装3d后观察到绿色荧光蛋白(GFP)表达,CsCl梯度离心纯化最终获得7.2×1010pfu/mL滴度的重组病毒;用该滴度病毒重新感染293细胞3 d后,提取细胞总RNA,RT-PCR检测E6/E7有表达.结论 利用新型腺病毒载体AdEasy系统可在短期内制备同时表达GFP和E6/E7的重组腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA.这将为进一步研究HPV-16 E6/E7基因功能及利用基因治疗女性宫颈癌奠定了基础.
目的 利用AdEasy繫統構建攜帶人角蛋白啟動子的人乳頭瘤病毒-16(HPV-16)E6/E7基因重組腺病毒,併通過RT-PCR方法檢測E6/E7基因的錶達.方法 應用PCR方法從含有HPV-16全基因序列的質粒上擴增E6/E7基因,構建pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA載體,擴增、酶切穫得K14-E6/E7-polA片段插入腺病毒穿梭載體質粒pAdTrack上,構建重組穿梭載體pAdTrack-K14-E6/E7-polA,線性化後與骨架載體AdEasy-1在細菌BJ5183內同源重組得到腺病毒質粒pAd-K14-E6/E7-polA,經人胚腎293細胞包裝後得到重組腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA.氫化銫(CsCl)梯度離心純化病毒,提取病毒再感染後的293細胞總RNA,通過RT-PCR方法檢測E6/E7基因的錶達.結果 通過同源重組的方法構建瞭腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA載體,經酶切和測序鑒定該質粒構建成功.293細胞包裝3d後觀察到綠色熒光蛋白(GFP)錶達,CsCl梯度離心純化最終穫得7.2×1010pfu/mL滴度的重組病毒;用該滴度病毒重新感染293細胞3 d後,提取細胞總RNA,RT-PCR檢測E6/E7有錶達.結論 利用新型腺病毒載體AdEasy繫統可在短期內製備同時錶達GFP和E6/E7的重組腺病毒pAd-K14-E6/E7-polA.這將為進一步研究HPV-16 E6/E7基因功能及利用基因治療女性宮頸癌奠定瞭基礎.
목적 이용AdEasy계통구건휴대인각단백계동자적인유두류병독-16(HPV-16)E6/E7기인중조선병독,병통과RT-PCR방법검측E6/E7기인적표체.방법 응용PCR방법종함유HPV-16전기인서렬적질립상확증E6/E7기인,구건pCDNA3.1(-)-K14-E6/E7-polA재체,확증、매절획득K14-E6/E7-polA편단삽입선병독천사재체질립pAdTrack상,구건중조천사재체pAdTrack-K14-E6/E7-polA,선성화후여골가재체AdEasy-1재세균BJ5183내동원중조득도선병독질립pAd-K14-E6/E7-polA,경인배신293세포포장후득도중조선병독pAd-K14-E6/E7-polA.경화색(CsCl)제도리심순화병독,제취병독재감염후적293세포총RNA,통과RT-PCR방법검측E6/E7기인적표체.결과 통과동원중조적방법구건료선병독pAd-K14-E6/E7-polA재체,경매절화측서감정해질립구건성공.293세포포장3d후관찰도록색형광단백(GFP)표체,CsCl제도리심순화최종획득7.2×1010pfu/mL적도적중조병독;용해적도병독중신감염293세포3 d후,제취세포총RNA,RT-PCR검측E6/E7유표체.결론 이용신형선병독재체AdEasy계통가재단기내제비동시표체GFP화E6/E7적중조선병독pAd-K14-E6/E7-polA.저장위진일보연구HPV-16 E6/E7기인공능급이용기인치료녀성궁경암전정료기출.
