CAJ | 학술논문

X连锁遗传性铁粒幼细胞贫血(XLSA)是红系特异性δ-氨基γ-酮戊酸合酶(δ-amionlevulinic acid syntase 2,ALAS2)基因突变造成的,本研究构建ALAS2基因的真核表达载体,观察表达载体转染真核细胞后蛋白表达的情况.将获自人胎肝的ALAS2基因插入到红色荧光蛋白质粒pDs-red2-N1中,命名为pDs-red2-N1/ALAS2;采用电穿孔方法将质粒转染K562细胞;转染后48小时提取细胞总RNA,进行RT-PCR检测ALAS2基因表达;流式细胞术检测红色荧光蛋白表达.再采用脂质体方法将质粒转染COS7细胞,转染后72小时提取细胞总RNA,RT-PCR检测ALAS2基因表达,荧光显微镜观察COS7细胞红色荧光蛋白表达情况.结果表明:构建了一种pDs-red2-N1/ALAS2真核表达载体,提取质粒DNA经酶切、电泳可以看到在4 700bp和1 764 bp处存在两条电泳条带;全长测序证实构建的载体序列正确;质粒转染K562和COS7细胞后均出现阳性ALAS2基因转录产物;流式细胞术检测转染后K562细胞红色荧光蛋白表达的阳性细胞百分率为19.2%;荧光显微镜显示转染后COS7细胞红色荧光蛋白,表达高峰出现在转染后第3天,阳性细胞百分率为10.7%,并可持续表达10天左右.红色荧光蛋白的表达可以间接说明ALAS2基因的表达.结论:ALAS2基因的真核表达载体构建成功,可以通过电穿孔和脂质体的方法转染真核细胞中并在其胞浆中表达,有可能用于XLSA患者基因替代治疗.
X련쇄유전성철립유세포빈혈(XLSA)시홍계특이성δ-안기γ-동무산합매(δ-amionlevulinic acid syntase 2,ALAS2)기인돌변조성적,본연구구건ALAS2기인적진핵표체재체,관찰표체재체전염진핵세포후단백표체적정황.장획자인태간적ALAS2기인삽입도홍색형광단백질립pDs-red2-N1중,명명위pDs-red2-N1/ALAS2;채용전천공방법장질립전염K562세포;전염후48소시제취세포총RNA,진행RT-PCR검측ALAS2기인표체;류식세포술검측홍색형광단백표체.재채용지질체방법장질립전염COS7세포,전염후72소시제취세포총RNA,RT-PCR검측ALAS2기인표체,형광현미경관찰COS7세포홍색형광단백표체정황.결과표명:구건료일충pDs-red2-N1/ALAS2진핵표체재체,제취질립DNA경매절、전영가이간도재4 700bp화1 764 bp처존재량조전영조대;전장측서증실구건적재체서렬정학;질립전염K562화COS7세포후균출현양성ALAS2기인전록산물;류식세포술검측전염후K562세포홍색형광단백표체적양성세포백분솔위19.2%;형광현미경현시전염후COS7세포홍색형광단백,표체고봉출현재전염후제3천,양성세포백분솔위10.7%,병가지속표체10천좌우.홍색형광단백적표체가이간접설명ALAS2기인적표체.결론:ALAS2기인적진핵표체재체구건성공,가이통과전천공화지질체적방법전염진핵세포중병재기포장중표체,유가능용우XLSA환자기인체대치료.