安徽医学
安徽醫學
안휘의학
ANHUI MEDICAL JOURNAL
2012年
2期
136-140
,共5页
李娟%唐刘君%王晓辉%查欣%胡中倩%邢小翠%杨晓明%汪思应
李娟%唐劉君%王曉輝%查訢%鬍中倩%邢小翠%楊曉明%汪思應
리연%당류군%왕효휘%사흔%호중천%형소취%양효명%왕사응
CDCA3蛋白%RNA干扰%shRNA%载体构建
CDCA3蛋白%RNA榦擾%shRNA%載體構建
CDCA3단백%RNA간우%shRNA%재체구건
目的 设计能转录短发夹状RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,构建能有效下调CDCA3蛋白表达的shRNA真核表达载体,研究其对CDCA3表达的影响,以便进一步研究CDCA3的功能.方法 根据文献获得CDCA3的siRNA靶序列,依据RNA干扰机制和shRNA靶序列的设计原则,以CDCA3基因为靶基因,合成一对编码shRNA的两条DNA序列,经退火后合成DNA双链,再克隆至shRNA表达载体pSIREN-DNRDsRed质粒中,连接产物转化E.coilJM109感受态细胞,然后挑取克隆提质粒,进行酶切鉴定和DNA序列测定.将构建成功的载体通过脂质体介导转染导入人胚肾HEK293细胞,采用Western blot法和Real time RT-PCR,检测特异性shRNA对CDCA3蛋白在mRNA及蛋白表达水平的抑制效果.结果 成功构建靶向CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体;转染HEK293细胞后,可显著下调CDCA3在细胞内的mRNA水平及蛋白表达水平.结论 CDCA3蛋白的特异shRNA的真核表达载体能显著下调HEK293细胞内的CDCA3蛋白表达.成功构建CDCA3 shRNA表达载体,为进一步研究CDCA3基因的功能提供了实验基础.
目的 設計能轉錄短髮夾狀RNA(short hairpin RNAs,shRNA)的DNA序列,構建能有效下調CDCA3蛋白錶達的shRNA真覈錶達載體,研究其對CDCA3錶達的影響,以便進一步研究CDCA3的功能.方法 根據文獻穫得CDCA3的siRNA靶序列,依據RNA榦擾機製和shRNA靶序列的設計原則,以CDCA3基因為靶基因,閤成一對編碼shRNA的兩條DNA序列,經退火後閤成DNA雙鏈,再剋隆至shRNA錶達載體pSIREN-DNRDsRed質粒中,連接產物轉化E.coilJM109感受態細胞,然後挑取剋隆提質粒,進行酶切鑒定和DNA序列測定.將構建成功的載體通過脂質體介導轉染導入人胚腎HEK293細胞,採用Western blot法和Real time RT-PCR,檢測特異性shRNA對CDCA3蛋白在mRNA及蛋白錶達水平的抑製效果.結果 成功構建靶嚮CDCA3蛋白的特異shRNA的真覈錶達載體;轉染HEK293細胞後,可顯著下調CDCA3在細胞內的mRNA水平及蛋白錶達水平.結論 CDCA3蛋白的特異shRNA的真覈錶達載體能顯著下調HEK293細胞內的CDCA3蛋白錶達.成功構建CDCA3 shRNA錶達載體,為進一步研究CDCA3基因的功能提供瞭實驗基礎.
목적 설계능전록단발협상RNA(short hairpin RNAs,shRNA)적DNA서렬,구건능유효하조CDCA3단백표체적shRNA진핵표체재체,연구기대CDCA3표체적영향,이편진일보연구CDCA3적공능.방법 근거문헌획득CDCA3적siRNA파서렬,의거RNA간우궤제화shRNA파서렬적설계원칙,이CDCA3기인위파기인,합성일대편마shRNA적량조DNA서렬,경퇴화후합성DNA쌍련,재극륭지shRNA표체재체pSIREN-DNRDsRed질립중,련접산물전화E.coilJM109감수태세포,연후도취극륭제질립,진행매절감정화DNA서렬측정.장구건성공적재체통과지질체개도전염도입인배신HEK293세포,채용Western blot법화Real time RT-PCR,검측특이성shRNA대CDCA3단백재mRNA급단백표체수평적억제효과.결과 성공구건파향CDCA3단백적특이shRNA적진핵표체재체;전염HEK293세포후,가현저하조CDCA3재세포내적mRNA수평급단백표체수평.결론 CDCA3단백적특이shRNA적진핵표체재체능현저하조HEK293세포내적CDCA3단백표체.성공구건CDCA3 shRNA표체재체,위진일보연구CDCA3기인적공능제공료실험기출.
