卫生研究
衛生研究
위생연구
JOURNAL OF HYGIENE RESEARCH
2006年
5期
540-542
,共3页
魏青%刘移民%王辉%招小林%任铁玲%肖勇梅
魏青%劉移民%王輝%招小林%任鐵玲%肖勇梅
위청%류이민%왕휘%초소림%임철령%초용매
定点突变%CYP1A1%测序分析
定點突變%CYP1A1%測序分析
정점돌변%CYP1A1%측서분석
目的 构建P4501A1基因cDNA Thr461→Asn461及Ile462→Val462突变载体,为进一步研究CYP1A1的功能和致癌机制奠定基础.方法 根据人CYP1A1基因(GeneBank NM-000499)cDNA序列设计通用引物Pm3/Pm4和突变引物Pt15/Pt16;Pt17/Pt18,内含酶切位点和突变位点,先用Pm3/Pt16,Pm3/Pt18组成两对引物,以pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第一轮扩增,获得上游1397bp片断,再用Pt15/Pm4,Pt17/Pm4组成两对引物以10ng pGEM-T-CYP1A1质粒为模板进行第二轮扩增,得到下游177bp片断.然后用Pm3/Pm4做引物以第一、第二轮扩增产物为模板进行第三轮扩增,获得的1.5kb扩增产物用1%琼脂糖凝胶分离并回收纯化,将纯化的PCR产物与pMD-T载体连接后转化大肠埃希菌DHα5感受态细胞,挑单克隆扩增、质粒抽提后进行酶切和测序鉴定.结果 三轮PCR扩增得到的1.5kb片断,经内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化和T7p和SP6通用引物进行双向测序,证实克隆的目的片段与GeneBank中人CYP1A1基因cDNA的序列同源性为99.9%,且包含两个设计的突变位点Asn461、Val462.结论 本实验成功地构建了含突变位点Asn461、Val462的CYP1A1基因cDNA的片断.
目的 構建P4501A1基因cDNA Thr461→Asn461及Ile462→Val462突變載體,為進一步研究CYP1A1的功能和緻癌機製奠定基礎.方法 根據人CYP1A1基因(GeneBank NM-000499)cDNA序列設計通用引物Pm3/Pm4和突變引物Pt15/Pt16;Pt17/Pt18,內含酶切位點和突變位點,先用Pm3/Pt16,Pm3/Pt18組成兩對引物,以pGEM-T-CYP1A1質粒為模闆進行第一輪擴增,穫得上遊1397bp片斷,再用Pt15/Pm4,Pt17/Pm4組成兩對引物以10ng pGEM-T-CYP1A1質粒為模闆進行第二輪擴增,得到下遊177bp片斷.然後用Pm3/Pm4做引物以第一、第二輪擴增產物為模闆進行第三輪擴增,穫得的1.5kb擴增產物用1%瓊脂糖凝膠分離併迴收純化,將純化的PCR產物與pMD-T載體連接後轉化大腸埃希菌DHα5感受態細胞,挑單剋隆擴增、質粒抽提後進行酶切和測序鑒定.結果 三輪PCR擴增得到的1.5kb片斷,經內切酶BamHⅠ和SalⅠ消化和T7p和SP6通用引物進行雙嚮測序,證實剋隆的目的片段與GeneBank中人CYP1A1基因cDNA的序列同源性為99.9%,且包含兩箇設計的突變位點Asn461、Val462.結論 本實驗成功地構建瞭含突變位點Asn461、Val462的CYP1A1基因cDNA的片斷.
목적 구건P4501A1기인cDNA Thr461→Asn461급Ile462→Val462돌변재체,위진일보연구CYP1A1적공능화치암궤제전정기출.방법 근거인CYP1A1기인(GeneBank NM-000499)cDNA서렬설계통용인물Pm3/Pm4화돌변인물Pt15/Pt16;Pt17/Pt18,내함매절위점화돌변위점,선용Pm3/Pt16,Pm3/Pt18조성량대인물,이pGEM-T-CYP1A1질립위모판진행제일륜확증,획득상유1397bp편단,재용Pt15/Pm4,Pt17/Pm4조성량대인물이10ng pGEM-T-CYP1A1질립위모판진행제이륜확증,득도하유177bp편단.연후용Pm3/Pm4주인물이제일、제이륜확증산물위모판진행제삼륜확증,획득적1.5kb확증산물용1%경지당응효분리병회수순화,장순화적PCR산물여pMD-T재체련접후전화대장애희균DHα5감수태세포,도단극륭확증、질립추제후진행매절화측서감정.결과 삼륜PCR확증득도적1.5kb편단,경내절매BamHⅠ화SalⅠ소화화T7p화SP6통용인물진행쌍향측서,증실극륭적목적편단여GeneBank중인CYP1A1기인cDNA적서렬동원성위99.9%,차포함량개설계적돌변위점Asn461、Val462.결론 본실험성공지구건료함돌변위점Asn461、Val462적CYP1A1기인cDNA적편단.
