首都医科大学学报
首都醫科大學學報
수도의과대학학보
JOURNAL OF CAPITAL UNIVERSITY OF MEDICAL SCIENCES
2007年
2期
229-233
,共5页
王雅梅%孙丽翠%闫豫东%司杨%张静宜%祁雅慧
王雅梅%孫麗翠%閆豫東%司楊%張靜宜%祁雅慧
왕아매%손려취%염예동%사양%장정의%기아혜
人碱性成纤维细胞生长因子%Bac-to-Bac杆状病毒表达系统%昆虫细胞%基因表达
人堿性成纖維細胞生長因子%Bac-to-Bac桿狀病毒錶達繫統%昆蟲細胞%基因錶達
인감성성섬유세포생장인자%Bac-to-Bac간상병독표체계통%곤충세포%기인표체
目的 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人碱性成纤维细胞生长因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因进行表达,并检测重组蛋白的特异性及生物学活性.方法 将人bFGF的cDNA克隆至杆状病毒转座载体pFastBacHTb中,并转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细菌DH10Bac中,获得重组Bacmid/bFGF;纯化DNA后,转染昆虫细胞Sf21,PCR鉴定重组病毒;进一步将重组病毒感染Sf21细胞,在Sf21细胞中进行表达,对表达产物进行SDS-PAGE电泳、Western bloting分析;MTT法检测表达产物的生物活性.结果 重组Bacmid/bFGF DNA直接转染昆虫细胞得到重组病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8.重组病毒在感染后48 h开始出现一相对分子质量为23 000大小的特异带,感染后72 h蛋白量明显增加,96 h蛋白量达到最大,120 h蛋白量开始减少.在正常昆虫Sf21细胞的对照中未见该蛋白带.Western bloting显示目的蛋白条带与人bFGF抗体发生特异反应.MTT结果显示重组蛋白能明显促进3T3细胞的分裂增殖.结论 利用杆状病毒表达系统可成功表达具有生物学活性的bFGF蛋白.
目的 利用Bac-to-Bac桿狀病毒錶達繫統,將人堿性成纖維細胞生長因子(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)基因進行錶達,併檢測重組蛋白的特異性及生物學活性.方法 將人bFGF的cDNA剋隆至桿狀病毒轉座載體pFastBacHTb中,併轉化到含穿梭載體Bacmid的感受態細菌DH10Bac中,穫得重組Bacmid/bFGF;純化DNA後,轉染昆蟲細胞Sf21,PCR鑒定重組病毒;進一步將重組病毒感染Sf21細胞,在Sf21細胞中進行錶達,對錶達產物進行SDS-PAGE電泳、Western bloting分析;MTT法檢測錶達產物的生物活性.結果 重組Bacmid/bFGF DNA直接轉染昆蟲細胞得到重組病毒rAcV-Bac-bFGF,病毒滴度MOI值≈8.重組病毒在感染後48 h開始齣現一相對分子質量為23 000大小的特異帶,感染後72 h蛋白量明顯增加,96 h蛋白量達到最大,120 h蛋白量開始減少.在正常昆蟲Sf21細胞的對照中未見該蛋白帶.Western bloting顯示目的蛋白條帶與人bFGF抗體髮生特異反應.MTT結果顯示重組蛋白能明顯促進3T3細胞的分裂增殖.結論 利用桿狀病毒錶達繫統可成功錶達具有生物學活性的bFGF蛋白.
목적 이용Bac-to-Bac간상병독표체계통,장인감성성섬유세포생장인자(human basic fibroblast growth factor,hbFGF)기인진행표체,병검측중조단백적특이성급생물학활성.방법 장인bFGF적cDNA극륭지간상병독전좌재체pFastBacHTb중,병전화도함천사재체Bacmid적감수태세균DH10Bac중,획득중조Bacmid/bFGF;순화DNA후,전염곤충세포Sf21,PCR감정중조병독;진일보장중조병독감염Sf21세포,재Sf21세포중진행표체,대표체산물진행SDS-PAGE전영、Western bloting분석;MTT법검측표체산물적생물활성.결과 중조Bacmid/bFGF DNA직접전염곤충세포득도중조병독rAcV-Bac-bFGF,병독적도MOI치≈8.중조병독재감염후48 h개시출현일상대분자질량위23 000대소적특이대,감염후72 h단백량명현증가,96 h단백량체도최대,120 h단백량개시감소.재정상곤충Sf21세포적대조중미견해단백대.Western bloting현시목적단백조대여인bFGF항체발생특이반응.MTT결과현시중조단백능명현촉진3T3세포적분렬증식.결론 이용간상병독표체계통가성공표체구유생물학활성적bFGF단백.
