高等学校化学学报
高等學校化學學報
고등학교화학학보
CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES
2012年
3期
521-525
,共5页
S-腺苷-L-高半胱氨酸%S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶%S-核糖基高半胱氨酸酶%S-腺苷甲硫氨酸依赖甲基转移酶%酶偶联分析
S-腺苷-L-高半胱氨痠%S-腺苷-L-高半胱氨痠覈苷酶%S-覈糖基高半胱氨痠酶%S-腺苷甲硫氨痠依賴甲基轉移酶%酶偶聯分析
S-선감-L-고반광안산%S-선감-L-고반광안산핵감매%S-핵당기고반광안산매%S-선감갑류안산의뢰갑기전이매%매우련분석
通过PCR扩增获得了S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(SAHN)和S-核糖基高半胱氨酸酶(SRHH)的基因序列,克隆入表达载体,转化宿主细胞,表达纯化得到带有组氨酸标签的重组蛋白,基于SAHN和SRHH重组酶建立了一种酶偶联分析S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)依赖的甲基转移酶活性的检测方法.甲基转移酶的共同产物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)首先被SAHN酶水解生成腺嘌呤和S-核苷高半胱氨酸,后者进一步被SRHH酶裂解生成高半胱氨酸,最后高半胱氨酸与Ellman's试剂反应生成5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB).实验结果表明,重组表达获取的2种酶蛋白均具有良好的催化活性,酶偶联反应生成的TNB与初始AdoHcy浓度呈现显著的线性正相关.该检测方法克服了S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶的共同产物AdoHcy的反馈抑制,使甲基化反应进行完全,从而保证了对甲基转移酶活性准确有效的定量分析.
通過PCR擴增穫得瞭S-腺苷-L-高半胱氨痠覈苷酶(SAHN)和S-覈糖基高半胱氨痠酶(SRHH)的基因序列,剋隆入錶達載體,轉化宿主細胞,錶達純化得到帶有組氨痠標籤的重組蛋白,基于SAHN和SRHH重組酶建立瞭一種酶偶聯分析S-腺苷甲硫氨痠(AdoMet)依賴的甲基轉移酶活性的檢測方法.甲基轉移酶的共同產物S-腺苷-L-高半胱氨痠(AdoHcy)首先被SAHN酶水解生成腺嘌呤和S-覈苷高半胱氨痠,後者進一步被SRHH酶裂解生成高半胱氨痠,最後高半胱氨痠與Ellman's試劑反應生成5-硫代-2-硝基苯甲痠(TNB).實驗結果錶明,重組錶達穫取的2種酶蛋白均具有良好的催化活性,酶偶聯反應生成的TNB與初始AdoHcy濃度呈現顯著的線性正相關.該檢測方法剋服瞭S-腺苷甲硫氨痠依賴的甲基轉移酶的共同產物AdoHcy的反饋抑製,使甲基化反應進行完全,從而保證瞭對甲基轉移酶活性準確有效的定量分析.
통과PCR확증획득료S-선감-L-고반광안산핵감매(SAHN)화S-핵당기고반광안산매(SRHH)적기인서렬,극륭입표체재체,전화숙주세포,표체순화득도대유조안산표첨적중조단백,기우SAHN화SRHH중조매건립료일충매우련분석S-선감갑류안산(AdoMet)의뢰적갑기전이매활성적검측방법.갑기전이매적공동산물S-선감-L-고반광안산(AdoHcy)수선피SAHN매수해생성선표령화S-핵감고반광안산,후자진일보피SRHH매렬해생성고반광안산,최후고반광안산여Ellman's시제반응생성5-류대-2-초기분갑산(TNB).실험결과표명,중조표체획취적2충매단백균구유량호적최화활성,매우련반응생성적TNB여초시AdoHcy농도정현현저적선성정상관.해검측방법극복료S-선감갑류안산의뢰적갑기전이매적공동산물AdoHcy적반궤억제,사갑기화반응진행완전,종이보증료대갑기전이매활성준학유효적정량분석.
