激光生物学报
激光生物學報
격광생물학보
ACTA LASER BIOLOGY SINICA
2012年
1期
46-51
,共6页
许鹏%王蕾蕾%程备久%范军
許鵬%王蕾蕾%程備久%範軍
허붕%왕뢰뢰%정비구%범군
分子伴侣%大肠杆菌%表达载体%粘性末端PCR技术%蛋白可溶性
分子伴侶%大腸桿菌%錶達載體%粘性末耑PCR技術%蛋白可溶性
분자반려%대장간균%표체재체%점성말단PCR기술%단백가용성
大肠杆菌(Escherichia coli)共表达系统常要求质粒具有不同抗生素抗性以及不同的复制子.利用粘性末端PCR技术,以含有大肠杆菌分子伴侣基因GroEL、GroES和GrpE的pR-GESP质粒为模板,设计两对引物,通过两次独立的PCR反应扩增3个基因的多顺反子,将形成粘性末端的PCR产物插入NcoI和XhoI酶切的pACY-CDuet-1质粒,构建的pA-GESP质粒具有p15A复制子及氯霉素抗性,和具有ColE1复制子及卡那霉素抗性表达载体pET28b相容.SDS-PAGE显示含有pA-GESP质粒的大肠杆菌细胞中3个分子伴侣蛋白的表达水平和含有pR-GESP质粒的大肠杆菌细胞没有明显差异,它们对玉米丝氨酸消旋酶的可溶性表达有部分促进作用,但对N端含有组氨酸标签的玉米铁氧还蛋白还原酶的表达没有作用,在三个含有不同抗生素基因的质粒中共表达分子伴侣、5-氨基乙酰丙酸合酶和尿卟啉原Ⅲ甲基化酶,两个酶连续催化的荧光产物在细胞内积累量为562.13±3.17/OD600,而没有分子伴侣的积累量为457.66±4.98/0D600,表明分子伴侣改善部分蛋白在大肠杆菌的可溶性表达和催化功能.
大腸桿菌(Escherichia coli)共錶達繫統常要求質粒具有不同抗生素抗性以及不同的複製子.利用粘性末耑PCR技術,以含有大腸桿菌分子伴侶基因GroEL、GroES和GrpE的pR-GESP質粒為模闆,設計兩對引物,通過兩次獨立的PCR反應擴增3箇基因的多順反子,將形成粘性末耑的PCR產物插入NcoI和XhoI酶切的pACY-CDuet-1質粒,構建的pA-GESP質粒具有p15A複製子及氯黴素抗性,和具有ColE1複製子及卡那黴素抗性錶達載體pET28b相容.SDS-PAGE顯示含有pA-GESP質粒的大腸桿菌細胞中3箇分子伴侶蛋白的錶達水平和含有pR-GESP質粒的大腸桿菌細胞沒有明顯差異,它們對玉米絲氨痠消鏇酶的可溶性錶達有部分促進作用,但對N耑含有組氨痠標籤的玉米鐵氧還蛋白還原酶的錶達沒有作用,在三箇含有不同抗生素基因的質粒中共錶達分子伴侶、5-氨基乙酰丙痠閤酶和尿卟啉原Ⅲ甲基化酶,兩箇酶連續催化的熒光產物在細胞內積纍量為562.13±3.17/OD600,而沒有分子伴侶的積纍量為457.66±4.98/0D600,錶明分子伴侶改善部分蛋白在大腸桿菌的可溶性錶達和催化功能.
대장간균(Escherichia coli)공표체계통상요구질립구유불동항생소항성이급불동적복제자.이용점성말단PCR기술,이함유대장간균분자반려기인GroEL、GroES화GrpE적pR-GESP질립위모판,설계량대인물,통과량차독립적PCR반응확증3개기인적다순반자,장형성점성말단적PCR산물삽입NcoI화XhoI매절적pACY-CDuet-1질립,구건적pA-GESP질립구유p15A복제자급록매소항성,화구유ColE1복제자급잡나매소항성표체재체pET28b상용.SDS-PAGE현시함유pA-GESP질립적대장간균세포중3개분자반려단백적표체수평화함유pR-GESP질립적대장간균세포몰유명현차이,타문대옥미사안산소선매적가용성표체유부분촉진작용,단대N단함유조안산표첨적옥미철양환단백환원매적표체몰유작용,재삼개함유불동항생소기인적질립중공표체분자반려、5-안기을선병산합매화뇨계람원Ⅲ갑기화매,량개매련속최화적형광산물재세포내적루량위562.13±3.17/OD600,이몰유분자반려적적루량위457.66±4.98/0D600,표명분자반려개선부분단백재대장간균적가용성표체화최화공능.
