世界华人消化杂志
世界華人消化雜誌
세계화인소화잡지
WORLD CHINESE JOURNAL OF DIGESTOLOGY
2005年
20期
2413-2419
,共7页
徐智%沈苏南%钱晓萍%禹立霞%刘宝瑞
徐智%瀋囌南%錢曉萍%禹立霞%劉寶瑞
서지%침소남%전효평%우립하%류보서
肝癌%CD40L%质粒%真核表达载体
肝癌%CD40L%質粒%真覈錶達載體
간암%CD40L%질립%진핵표체재체
目的:构建含人CD40 ligand(CD40L)基因的真核表达载体,并使之在人肝癌细胞HepG2中表达,研究CD40L稳定表达对HepG2细胞的影响.方法:从人外周血单个核细胞总RNA中经RT-PCR扩增出人CD40L基因,经过酶切连接进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A制备重组质粒.重组质粒经酶切及测序证实人CD40L基因成功克隆进入真核表达载体pcDNATM3.1/myc-His(-)A,并进一步转入大肠杆菌(E.coli DH5α)大量扩增.实验分4组,A组HepG2细胞转染重组质粒,B组HepG2细胞转染不含CD40L cDNA的空质粒,C组HepG2细胞正常培养,D组HepG2细胞加入G418作为转染对照.RT-PCR及流式细胞术鉴定A,B,C 3组细胞表面CD40L和CD40的表达后,A,B,C 3组细胞分别设6个复孔培养72 h后,流式细胞术检测细胞凋亡、细胞周期分布和Fas表达.结果:测序结果显示人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A构建成功.流式细胞术检测A组HepG2细胞表面CD40L表达为39.7%,CD40表达为15.4%;B和C组细胞表面仅有CD40表达,分别为31.7%和28.5%.A组细胞凋亡率45.0±0.3%,B,C组均未发生明显凋亡(P＜0.01).与C组细胞比较,A组细胞周期分布主要阻滞在G1期(90.4±1.3% vs 60.6±1.5%,P＜0.01),S期(6.32±1.0% vs12.0±0.7%)和G2/M期分布(3.3±0.7% vs 27.3±1.2%)均有减少(P＜0.01).A组细胞Fas表达率(27.8±1.5%)较B组(3.2±0.8%)和C组(4.2±1.0%)明显上调(P＜0.01).结论:我们构建的人CD40L基因真核表达质粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A可以在人肝癌细胞HepG2中稳定表达,CD40L对于HepG2细胞具有促凋亡的作用,这可能与CD40L-CD40作用后导致HepG2细胞Fas表达上调和细胞周期阻滞有关.
目的:構建含人CD40 ligand(CD40L)基因的真覈錶達載體,併使之在人肝癌細胞HepG2中錶達,研究CD40L穩定錶達對HepG2細胞的影響.方法:從人外週血單箇覈細胞總RNA中經RT-PCR擴增齣人CD40L基因,經過酶切連接進入真覈錶達載體pcDNATM3.1/myc-His(-)A製備重組質粒.重組質粒經酶切及測序證實人CD40L基因成功剋隆進入真覈錶達載體pcDNATM3.1/myc-His(-)A,併進一步轉入大腸桿菌(E.coli DH5α)大量擴增.實驗分4組,A組HepG2細胞轉染重組質粒,B組HepG2細胞轉染不含CD40L cDNA的空質粒,C組HepG2細胞正常培養,D組HepG2細胞加入G418作為轉染對照.RT-PCR及流式細胞術鑒定A,B,C 3組細胞錶麵CD40L和CD40的錶達後,A,B,C 3組細胞分彆設6箇複孔培養72 h後,流式細胞術檢測細胞凋亡、細胞週期分佈和Fas錶達.結果:測序結果顯示人CD40L基因真覈錶達質粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A構建成功.流式細胞術檢測A組HepG2細胞錶麵CD40L錶達為39.7%,CD40錶達為15.4%;B和C組細胞錶麵僅有CD40錶達,分彆為31.7%和28.5%.A組細胞凋亡率45.0±0.3%,B,C組均未髮生明顯凋亡(P＜0.01).與C組細胞比較,A組細胞週期分佈主要阻滯在G1期(90.4±1.3% vs 60.6±1.5%,P＜0.01),S期(6.32±1.0% vs12.0±0.7%)和G2/M期分佈(3.3±0.7% vs 27.3±1.2%)均有減少(P＜0.01).A組細胞Fas錶達率(27.8±1.5%)較B組(3.2±0.8%)和C組(4.2±1.0%)明顯上調(P＜0.01).結論:我們構建的人CD40L基因真覈錶達質粒CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A可以在人肝癌細胞HepG2中穩定錶達,CD40L對于HepG2細胞具有促凋亡的作用,這可能與CD40L-CD40作用後導緻HepG2細胞Fas錶達上調和細胞週期阻滯有關.
목적:구건함인CD40 ligand(CD40L)기인적진핵표체재체,병사지재인간암세포HepG2중표체,연구CD40L은정표체대HepG2세포적영향.방법:종인외주혈단개핵세포총RNA중경RT-PCR확증출인CD40L기인,경과매절련접진입진핵표체재체pcDNATM3.1/myc-His(-)A제비중조질립.중조질립경매절급측서증실인CD40L기인성공극륭진입진핵표체재체pcDNATM3.1/myc-His(-)A,병진일보전입대장간균(E.coli DH5α)대량확증.실험분4조,A조HepG2세포전염중조질립,B조HepG2세포전염불함CD40L cDNA적공질립,C조HepG2세포정상배양,D조HepG2세포가입G418작위전염대조.RT-PCR급류식세포술감정A,B,C 3조세포표면CD40L화CD40적표체후,A,B,C 3조세포분별설6개복공배양72 h후,류식세포술검측세포조망、세포주기분포화Fas표체.결과:측서결과현시인CD40L기인진핵표체질립CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A구건성공.류식세포술검측A조HepG2세포표면CD40L표체위39.7%,CD40표체위15.4%;B화C조세포표면부유CD40표체,분별위31.7%화28.5%.A조세포조망솔45.0±0.3%,B,C조균미발생명현조망(P＜0.01).여C조세포비교,A조세포주기분포주요조체재G1기(90.4±1.3% vs 60.6±1.5%,P＜0.01),S기(6.32±1.0% vs12.0±0.7%)화G2/M기분포(3.3±0.7% vs 27.3±1.2%)균유감소(P＜0.01).A조세포Fas표체솔(27.8±1.5%)교B조(3.2±0.8%)화C조(4.2±1.0%)명현상조(P＜0.01).결론:아문구건적인CD40L기인진핵표체질립CD40L-pcDNATM3.1/myc-His(-)A가이재인간암세포HepG2중은정표체,CD40L대우HepG2세포구유촉조망적작용,저가능여CD40L-CD40작용후도치HepG2세포Fas표체상조화세포주기조체유관.
