CAJ | 학술논문

目的基于肝脏发育生物学进展,建立有效诱导胚胎干细胞(ESC)向肝细胞分化的体外培养体系.方法小鼠ESC细胞系E14,在内含1000 U/ml的rmLIF的无饲养层高糖DMEM培养基中培养,去除rmLIF后用悬滴培养法制备成拟胚体.依次加入10-7M的Dexamethasone、10μg/L的FGF-4、25μg/L的HGF等诱导因子,继续培养1～2周.然后取分化细胞,行细胞形态学观察、免疫细胞化学染色检测白蛋白和CK8/18的表达、RT-PCR检测白蛋白和转甲状腺蛋白等肝细胞特征性蛋白的mRNA转录水平.糖原染色、尿素合成功能检测则对其功能进行检验.结果ESC体外培养生长旺盛,呈"巢状"克隆性增殖.去除rmLIF后悬浮培养,一般2～3 d可制备成拟胚体.序贯加入Dex、FGF-4和HGF等诱导因子进行分化培养后,约于ED12可见分散、克隆样增殖的小上皮样细胞集落,ED19左右有较多细胞分化为多角形的肝细胞样细胞.免疫组化染色,见胞浆内出现棕黄色颗粒,表达肝细胞特有的白蛋白以及CK8/18等蛋白.RT-PCR显示有白蛋白、转甲状腺蛋白等的mRNA转录.糖原染色见胞浆内存在红色颗粒,呈阳性反应;尿素合成功能检测显示,培养液内可见尿素氮的逐日升高,说明细胞具有肝细胞特有的糖原合成、尿素合成和分泌功能.结论加入FGF-4、HGF和Dex等肝脏胚胎发育时期的关键性调控因子的体外培养体系可以诱导胚胎干细胞分化为肝细胞样细胞.
목적기우간장발육생물학진전,건립유효유도배태간세포(ESC)향간세포분화적체외배양체계.방법소서ESC세포계E14,재내함1000 U/ml적rmLIF적무사양층고당DMEM배양기중배양,거제rmLIF후용현적배양법제비성의배체.의차가입10-7M적Dexamethasone、10μg/L적FGF-4、25μg/L적HGF등유도인자,계속배양1～2주.연후취분화세포,행세포형태학관찰、면역세포화학염색검측백단백화CK8/18적표체、RT-PCR검측백단백화전갑상선단백등간세포특정성단백적mRNA전록수평.당원염색、뇨소합성공능검측칙대기공능진행검험.결과ESC체외배양생장왕성,정"소상"극륭성증식.거제rmLIF후현부배양,일반2～3 d가제비성의배체.서관가입Dex、FGF-4화HGF등유도인자진행분화배양후,약우ED12가견분산、극륭양증식적소상피양세포집락,ED19좌우유교다세포분화위다각형적간세포양세포.면역조화염색,견포장내출현종황색과립,표체간세포특유적백단백이급CK8/18등단백.RT-PCR현시유백단백、전갑상선단백등적mRNA전록.당원염색견포장내존재홍색과립,정양성반응;뇨소합성공능검측현시,배양액내가견뇨소담적축일승고,설명세포구유간세포특유적당원합성、뇨소합성화분비공능.결론가입FGF-4、HGF화Dex등간장배태발육시기적관건성조공인자적체외배양체계가이유도배태간세포분화위간세포양세포.