CAJ | 학술논문

目的:克隆并原核表达粉尘螨变应原第2组分重组蛋白,鉴定其变应原性,分析其分子特征,为制备用于临床诊治的变应原奠定基础.方法:提取粉尘螨Total RNA,根据国际基因库 (AB195580)设计并合成引物,经RT-PCR合成Der f 2全长基因,与pMD19-T 载体连接后,热转化至E.coli JM109;将测序正确的Der f 2基因与pET28a(+) Vector连接,转化BL21(DE3),IPTG诱导表达;经镍琼脂糖凝胶FF亲和柱层析,收集各阶段洗脱峰用梯度透析法进行复性,Western blot鉴定重组蛋白的变应原性.用生物信息学软件预测其理化性质、空间结构,并构建分子进化树.结果:RT-PCR成功扩增获得目的基因Der f 2,全长441 bp,与参考序列同源性99.3%.将构建的pET28a(+)-Der f 2质粒转化宿主菌E.coli BL21诱导表达,SDS-PAGE电泳显示全细胞和沉淀物中均有蛋白表达.亲和柱层析后获得约3 86 mg重组蛋白纯品,Western blot分析表明其可与哮喘患儿血清IgE发生特异性结合.去除信号肽序列(1～17氨基酸)后,重组蛋白由129个氨基酸组成,相对分子质量为14.076,二级结构由延伸主链(30.82%),无规则卷曲(49.32%),α螺旋(19.86%)组成.该变应原可能位于线粒体,属ML域家族.序列比对显示,粉尘螨和屋尘螨、微角尘螨、梅氏嗜霉螨的相似度依次为88%、96%、83%,此四种螨在上述蜱螨变应原第2组分构建的分子进化树中聚成一簇,支持率达100%.结论:粉尘螨变应原第2组分原核表达获得成功,纯化后获得具有变应原性的重组蛋白,为进一步规模生产该变应原并用于临床诊治奠定基础;生物信息学分析初步获得了该变应原的分子特征,为进一步实验室验证指明方向.
목적:극륭병원핵표체분진만변응원제2조분중조단백,감정기변응원성,분석기분자특정,위제비용우림상진치적변응원전정기출.방법:제취분진만Total RNA,근거국제기인고 (AB195580)설계병합성인물,경RT-PCR합성Der f 2전장기인,여pMD19-T 재체련접후,열전화지E.coli JM109;장측서정학적Der f 2기인여pET28a(+) Vector련접,전화BL21(DE3),IPTG유도표체;경얼경지당응효FF친화주층석,수집각계단세탈봉용제도투석법진행복성,Western blot감정중조단백적변응원성.용생물신식학연건예측기이화성질、공간결구,병구건분자진화수.결과:RT-PCR성공확증획득목적기인Der f 2,전장441 bp,여삼고서렬동원성99.3%.장구건적pET28a(+)-Der f 2질립전화숙주균E.coli BL21유도표체,SDS-PAGE전영현시전세포화침정물중균유단백표체.친화주층석후획득약3 86 mg중조단백순품,Western blot분석표명기가여효천환인혈청IgE발생특이성결합.거제신호태서렬(1～17안기산)후,중조단백유129개안기산조성,상대분자질량위14.076,이급결구유연신주련(30.82%),무규칙권곡(49.32%),α라선(19.86%)조성.해변응원가능위우선립체,속ML역가족.서렬비대현시,분진만화옥진만、미각진만、매씨기매만적상사도의차위88%、96%、83%,차사충만재상술비만변응원제2조분구건적분자진화수중취성일족,지지솔체100%.결론:분진만변응원제2조분원핵표체획득성공,순화후획득구유변응원성적중조단백,위진일보규모생산해변응원병용우림상진치전정기출;생물신식학분석초보획득료해변응원적분자특정,위진일보실험실험증지명방향.