CAJ | 학술논문

目的:应用基因芯片生物信息学分析思路筛查大肠癌细胞相关基因Nrf3,构建融合蛋白真核表达载体,检测其对体外转染癌细胞周期与凋亡的影响.方法:实验于2004-01/2006-07在南方医科大学病理解剖教研室及肿瘤研究所与中国农业大学农业生物技术国家重点实验室完成.①实验材料:大肠癌细胞组织及其配对的正常大肠黏膜各3例,由解放军总医院病理科提供;大肠癌LoVo细胞系由南方医科大学肿瘤研究所提供;肝癌SMMC7721细胞系由解放军军事医学科学院放射医学研究所提供;真核表达载体pEGFP-N1(Clontech公司).②实验方法:分别应用Excel表、Affymetrix Microarray Suite Software 5.0分析软件和STATA7.0分析软件,对基因芯片表达谱数据行交集补集分析、秩和检验及T检验,筛选"最重要的大肠癌细胞差异表达基因&ESTs",差异表达P＜0.05,差异倍数＞2.应用文献轮廓法进一步分析确定首选研究基因为Nrf3,提取组织样品总RNA,cDNA合成,PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化,插入T载体中,Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接到pEGFP-N1载体,获得重组pEGFP-N1-Nrf3质粒.LoVo细胞在体外加入含体积分数为0.1小牛血清、100 u/mL青链霉素的RPMI-1640培养基,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中,待转染质粒pEGFP-N1-Nrf3与阴性对照质粒pEGFP-N1转染36 h后,荧光显微镜观察候选基因亚细胞定位,FCM分选术观察其在体外对LoVo细胞周期和凋亡的影响.同法观察重组pEGFP-N1-Nrf3质粒体外转染对SMMC7721细胞周期和凋亡的影响.结果:①首选研究大肠癌细胞相关基因的确认:多种统计学方法分析获得最重要的大肠癌细胞相关基因17个,文献轮廓法进一步确认Nrf3为首选研究基因.②Nrf3基因表达:RT-PCR法检测Nrf3在3例大肠癌细胞组织均有表达,而在与其相配对的正常黏膜中表达较弱或不表达,与芯片检测结果基本一致;Nrf3在LoVo细胞中有表达.③Nrf3亚细胞定位:重组pEGFP-N1-Nrf3质粒转染的LoVo细胞其绿色荧光主要分布于细胞核内,提示Nrf3可能定位于细胞核内.④Nrf3在体外对癌细胞周期与凋亡的影响:体外培养36 h后与未转染LoVo细胞的空白对照比较,重组pEGFP-N1-Nrf3质粒转染的LoVo细胞S+G2/M期所占比例明显减低,G2/M期下降尤为显著,G0/G1期细胞所占比例明显增加.Nrf3转染作用于LoVo细胞后,未观察到明显"亚G1"峰(即凋亡峰)的出现.Nrf3体外转染的SMMC7721细胞周期及凋亡情况与LoVo细胞基本相似.结论:大肠癌细胞相关基因Nrf3在体外能够抑制LoVo细胞、SMMC7721细胞的DNA合成和有丝分裂,促使癌细胞阻滞于G0/G1期,抑制其生长增殖的同时不影响细胞凋亡,可作为大肠癌细胞候选分子标志物. 目的:應用基因芯片生物信息學分析思路篩查大腸癌細胞相關基因Nrf3,構建融閤蛋白真覈錶達載體,檢測其對體外轉染癌細胞週期與凋亡的影響.方法:實驗于2004-01/2006-07在南方醫科大學病理解剖教研室及腫瘤研究所與中國農業大學農業生物技術國傢重點實驗室完成.①實驗材料:大腸癌細胞組織及其配對的正常大腸黏膜各3例,由解放軍總醫院病理科提供;大腸癌LoVo細胞繫由南方醫科大學腫瘤研究所提供;肝癌SMMC7721細胞繫由解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所提供;真覈錶達載體pEGFP-N1(Clontech公司).②實驗方法:分彆應用Excel錶、Affymetrix Microarray Suite Software 5.0分析軟件和STATA7.0分析軟件,對基因芯片錶達譜數據行交集補集分析、秩和檢驗及T檢驗,篩選"最重要的大腸癌細胞差異錶達基因&ESTs",差異錶達P＜0.05,差異倍數＞2.應用文獻輪廓法進一步分析確定首選研究基因為Nrf3,提取組織樣品總RNA,cDNA閤成,PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分離後迴收純化,插入T載體中,Sal Ⅰ和BamH Ⅰ雙酶切後連接到pEGFP-N1載體,穫得重組pEGFP-N1-Nrf3質粒.LoVo細胞在體外加入含體積分數為0.1小牛血清、100 u/mL青鏈黴素的RPMI-1640培養基,置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2飽和濕度培養箱中,待轉染質粒pEGFP-N1-Nrf3與陰性對照質粒pEGFP-N1轉染36 h後,熒光顯微鏡觀察候選基因亞細胞定位,FCM分選術觀察其在體外對LoVo細胞週期和凋亡的影響.同法觀察重組pEGFP-N1-Nrf3質粒體外轉染對SMMC7721細胞週期和凋亡的影響.結果:①首選研究大腸癌細胞相關基因的確認:多種統計學方法分析穫得最重要的大腸癌細胞相關基因17箇,文獻輪廓法進一步確認Nrf3為首選研究基因.②Nrf3基因錶達:RT-PCR法檢測Nrf3在3例大腸癌細胞組織均有錶達,而在與其相配對的正常黏膜中錶達較弱或不錶達,與芯片檢測結果基本一緻;Nrf3在LoVo細胞中有錶達.③Nrf3亞細胞定位:重組pEGFP-N1-Nrf3質粒轉染的LoVo細胞其綠色熒光主要分佈于細胞覈內,提示Nrf3可能定位于細胞覈內.④Nrf3在體外對癌細胞週期與凋亡的影響:體外培養36 h後與未轉染LoVo細胞的空白對照比較,重組pEGFP-N1-Nrf3質粒轉染的LoVo細胞S+G2/M期所佔比例明顯減低,G2/M期下降尤為顯著,G0/G1期細胞所佔比例明顯增加.Nrf3轉染作用于LoVo細胞後,未觀察到明顯"亞G1"峰(即凋亡峰)的齣現.Nrf3體外轉染的SMMC7721細胞週期及凋亡情況與LoVo細胞基本相似.結論:大腸癌細胞相關基因Nrf3在體外能夠抑製LoVo細胞、SMMC7721細胞的DNA閤成和有絲分裂,促使癌細胞阻滯于G0/G1期,抑製其生長增殖的同時不影響細胞凋亡,可作為大腸癌細胞候選分子標誌物.
목적:응용기인심편생물신식학분석사로사사대장암세포상관기인Nrf3,구건융합단백진핵표체재체,검측기대체외전염암세포주기여조망적영향.방법:실험우2004-01/2006-07재남방의과대학병리해부교연실급종류연구소여중국농업대학농업생물기술국가중점실험실완성.①실험재료:대장암세포조직급기배대적정상대장점막각3례,유해방군총의원병이과제공;대장암LoVo세포계유남방의과대학종류연구소제공;간암SMMC7721세포계유해방군군사의학과학원방사의학연구소제공;진핵표체재체pEGFP-N1(Clontech공사).②실험방법:분별응용Excel표、Affymetrix Microarray Suite Software 5.0분석연건화STATA7.0분석연건,대기인심편표체보수거행교집보집분석、질화검험급T검험,사선"최중요적대장암세포차이표체기인&ESTs",차이표체P＜0.05,차이배수＞2.응용문헌륜곽법진일보분석학정수선연구기인위Nrf3,제취조직양품총RNA,cDNA합성,PCR확증산물경경지당응효전영분리후회수순화,삽입T재체중,Sal Ⅰ화BamH Ⅰ쌍매절후련접도pEGFP-N1재체,획득중조pEGFP-N1-Nrf3질립.LoVo세포재체외가입함체적분수위0.1소우혈청、100 u/mL청련매소적RPMI-1640배양기,치우37 ℃、체적분수위0.05적CO2포화습도배양상중,대전염질립pEGFP-N1-Nrf3여음성대조질립pEGFP-N1전염36 h후,형광현미경관찰후선기인아세포정위,FCM분선술관찰기재체외대LoVo세포주기화조망적영향.동법관찰중조pEGFP-N1-Nrf3질립체외전염대SMMC7721세포주기화조망적영향.결과:①수선연구대장암세포상관기인적학인:다충통계학방법분석획득최중요적대장암세포상관기인17개,문헌륜곽법진일보학인Nrf3위수선연구기인.②Nrf3기인표체:RT-PCR법검측Nrf3재3례대장암세포조직균유표체,이재여기상배대적정상점막중표체교약혹불표체,여심편검측결과기본일치;Nrf3재LoVo세포중유표체.③Nrf3아세포정위:중조pEGFP-N1-Nrf3질립전염적LoVo세포기록색형광주요분포우세포핵내,제시Nrf3가능정위우세포핵내.④Nrf3재체외대암세포주기여조망적영향:체외배양36 h후여미전염LoVo세포적공백대조비교,중조pEGFP-N1-Nrf3질립전염적LoVo세포S+G2/M기소점비례명현감저,G2/M기하강우위현저,G0/G1기세포소점비례명현증가.Nrf3전염작용우LoVo세포후,미관찰도명현"아G1"봉(즉조망봉)적출현.Nrf3체외전염적SMMC7721세포주기급조망정황여LoVo세포기본상사.결론:대장암세포상관기인Nrf3재체외능구억제LoVo세포、SMMC7721세포적DNA합성화유사분렬,촉사암세포조체우G0/G1기,억제기생장증식적동시불영향세포조망,가작위대장암세포후선분자표지물.