眼科研究
眼科研究
안과연구
CHINESE OPHTHALMIC RESEARCH
2009年
10期
864-869
,共6页
詹文芳%蔡善君%刘锐%谢兵%李红%宿罡
詹文芳%蔡善君%劉銳%謝兵%李紅%宿罡
첨문방%채선군%류예%사병%리홍%숙강
内皮抑素%真核表达载体%人胚胎肾HEK-293细胞%Western%blot
內皮抑素%真覈錶達載體%人胚胎腎HEK-293細胞%Western%blot
내피억소%진핵표체재체%인배태신HEK-293세포%Western%blot
目的 构建分泌型人内皮抑素(ES)的真核表达载体pEGFP-N1-Endostatin重组质粒,鉴定其蛋白的体外瞬时表达.方法 以pcDNA3-Endo质粒为模板,通过PCR扩增获得人ES基因片段,且在基因前加信号肽序列,将其定向插入真核表达载体pEGFP-N1中,获得重组质粒pEGFP-N1-ES.采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切法、PCR法及插入片段序列测定法鉴定该质粒.利用阳离子脂质体介导法,将其转染到人胚胎肾HEK-293细胞中,采用免疫组织化学法和Western blot法检测转染细胞内及培养上清液中ES蛋白的表达.结果 通过HindⅢ和BamHⅠ双酶切、PCR及测序鉴定证明构建出了含ES基因的真核表达载体,且插入片段正确.采用免疫组织化学法和Western blot法检测表明HEK-293细胞内及培养上清中存在相对分子质量为20000的人ES蛋白表达.结论 成功构建了重组质粒pEGFP-N1-ES真核表达载体,转染HEK-293细胞后可稳定有效地分泌人ES蛋白.
目的 構建分泌型人內皮抑素(ES)的真覈錶達載體pEGFP-N1-Endostatin重組質粒,鑒定其蛋白的體外瞬時錶達.方法 以pcDNA3-Endo質粒為模闆,通過PCR擴增穫得人ES基因片段,且在基因前加信號肽序列,將其定嚮插入真覈錶達載體pEGFP-N1中,穫得重組質粒pEGFP-N1-ES.採用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切法、PCR法及插入片段序列測定法鑒定該質粒.利用暘離子脂質體介導法,將其轉染到人胚胎腎HEK-293細胞中,採用免疫組織化學法和Western blot法檢測轉染細胞內及培養上清液中ES蛋白的錶達.結果 通過HindⅢ和BamHⅠ雙酶切、PCR及測序鑒定證明構建齣瞭含ES基因的真覈錶達載體,且插入片段正確.採用免疫組織化學法和Western blot法檢測錶明HEK-293細胞內及培養上清中存在相對分子質量為20000的人ES蛋白錶達.結論 成功構建瞭重組質粒pEGFP-N1-ES真覈錶達載體,轉染HEK-293細胞後可穩定有效地分泌人ES蛋白.
목적 구건분비형인내피억소(ES)적진핵표체재체pEGFP-N1-Endostatin중조질립,감정기단백적체외순시표체.방법 이pcDNA3-Endo질립위모판,통과PCR확증획득인ES기인편단,차재기인전가신호태서렬,장기정향삽입진핵표체재체pEGFP-N1중,획득중조질립pEGFP-N1-ES.채용HindⅢ화BamHⅠ쌍매절법、PCR법급삽입편단서렬측정법감정해질립.이용양리자지질체개도법,장기전염도인배태신HEK-293세포중,채용면역조직화학법화Western blot법검측전염세포내급배양상청액중ES단백적표체.결과 통과HindⅢ화BamHⅠ쌍매절、PCR급측서감정증명구건출료함ES기인적진핵표체재체,차삽입편단정학.채용면역조직화학법화Western blot법검측표명HEK-293세포내급배양상청중존재상대분자질량위20000적인ES단백표체.결론 성공구건료중조질립pEGFP-N1-ES진핵표체재체,전염HEK-293세포후가은정유효지분비인ES단백.
