中国生物工程杂志
中國生物工程雜誌
중국생물공정잡지
JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY
2007年
7期
21-26
,共6页
万榕%宋军%郑海音%张晓艳%林旭%林建银
萬榕%宋軍%鄭海音%張曉豔%林旭%林建銀
만용%송군%정해음%장효염%림욱%림건은
蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂%毕赤酵母%分泌表达%B16F1细胞%侵袭
蛇毒半胱氨痠蛋白酶抑製劑%畢赤酵母%分泌錶達%B16F1細胞%侵襲
사독반광안산단백매억제제%필적효모%분비표체%B16F1세포%침습
目的:建立毕赤酵母表达质粒pPICZαA-cystatin,转化酵母细胞生产重组蛋白,探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)对肿瘤侵袭的生物学作用.方法:利用PCR扩增技术从pUC18/sv-cystatin质粒中扩增sv-cystatin cDNA并克隆至酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-cystatin电激转化Pichia pastori酵母细胞GS115,经1%甲醇诱导获得稳定表达的重组蛋白,改良Boyden小室分析重组sv-cystatin蛋白处理对B16F1细胞体外侵袭力的影响.结果:SDS-PAGE检测和Western blot分析显示分泌表达的sv-cystatin重组蛋白相对分子量约为14kDa,摇瓶发酵每升发酵培养上清可获得16 mg的重组蛋白,经亲和层析纯化获得的sv-cystatin重组蛋白具有抑制木瓜蛋白酶的活性.改良Boyden小室实验结果显示:经0.5mg/ml浓度的重组蛋白处理的B16F1细胞穿过Matrigel的细胞数明显低于对照组(52.60±4.58,106±5.9,P＜0.01) ,抑制率为50%.结论:成功实现sv-cystatin的酵母表达,初步证明sv-cystatin重组蛋白可抑制小鼠B16F1细胞体外侵袭作用.
目的:建立畢赤酵母錶達質粒pPICZαA-cystatin,轉化酵母細胞生產重組蛋白,探討蛇毒半胱氨痠蛋白酶抑製劑(sv-cystatin)對腫瘤侵襲的生物學作用.方法:利用PCR擴增技術從pUC18/sv-cystatin質粒中擴增sv-cystatin cDNA併剋隆至酵母錶達載體pPICZαA上,構建重組質粒pPICZαA-cystatin電激轉化Pichia pastori酵母細胞GS115,經1%甲醇誘導穫得穩定錶達的重組蛋白,改良Boyden小室分析重組sv-cystatin蛋白處理對B16F1細胞體外侵襲力的影響.結果:SDS-PAGE檢測和Western blot分析顯示分泌錶達的sv-cystatin重組蛋白相對分子量約為14kDa,搖瓶髮酵每升髮酵培養上清可穫得16 mg的重組蛋白,經親和層析純化穫得的sv-cystatin重組蛋白具有抑製木瓜蛋白酶的活性.改良Boyden小室實驗結果顯示:經0.5mg/ml濃度的重組蛋白處理的B16F1細胞穿過Matrigel的細胞數明顯低于對照組(52.60±4.58,106±5.9,P＜0.01) ,抑製率為50%.結論:成功實現sv-cystatin的酵母錶達,初步證明sv-cystatin重組蛋白可抑製小鼠B16F1細胞體外侵襲作用.
목적:건립필적효모표체질립pPICZαA-cystatin,전화효모세포생산중조단백,탐토사독반광안산단백매억제제(sv-cystatin)대종류침습적생물학작용.방법:이용PCR확증기술종pUC18/sv-cystatin질립중확증sv-cystatin cDNA병극륭지효모표체재체pPICZαA상,구건중조질립pPICZαA-cystatin전격전화Pichia pastori효모세포GS115,경1%갑순유도획득은정표체적중조단백,개량Boyden소실분석중조sv-cystatin단백처리대B16F1세포체외침습력적영향.결과:SDS-PAGE검측화Western blot분석현시분비표체적sv-cystatin중조단백상대분자량약위14kDa,요병발효매승발효배양상청가획득16 mg적중조단백,경친화층석순화획득적sv-cystatin중조단백구유억제목과단백매적활성.개량Boyden소실실험결과현시:경0.5mg/ml농도적중조단백처리적B16F1세포천과Matrigel적세포수명현저우대조조(52.60±4.58,106±5.9,P＜0.01) ,억제솔위50%.결론:성공실현sv-cystatin적효모표체,초보증명sv-cystatin중조단백가억제소서B16F1세포체외침습작용.
