解剖科学进展
解剖科學進展
해부과학진전
PROGRESS OF ANATOMICAL SCIENCES
2011年
5期
445-449
,共5页
杨明花%王帅%田昕%王扬%隋承光
楊明花%王帥%田昕%王颺%隋承光
양명화%왕수%전흔%왕양%수승광
4-1BBL%腺病毒%基因表达%共刺激分子
4-1BBL%腺病毒%基因錶達%共刺激分子
4-1BBL%선병독%기인표체%공자격분자
目的 体外构建含有人4-IBBL基因的重组腺病毒载体,并检测其在HEK293细胞中的表达.方法 设计一对含有Sfil酶切位点的4-1BBL因上下游引物,以质粒pCR4-TOP0-4-1BBL为模板,通过PCR扩增获得4-1BBL基因全序列.片段回收后经酶切处理,连接到穿梭质粒pShuttle-CMV-EGFP上,获得重组穿梭质粒pShuttle-ECFP-4-1BBL.经Sfil酶切、PCR及插入片段测序鉴定正确后,将其用I-Ceul和I-Scel双酶切处理,转移到pAdxsi载体上,得到pAdxsi-GFP-4-1BBL病毒质粒,PCR鉴定正确后,经HEK293细胞包装成复制缺陷型腺病毒Ad-4-1BBL,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,Western blot检测目的 基因人4-1BBL的表达.结果 酶切鉴定和序列分析证实,重组腺病毒质粒含有人4-1BBL全长cDNA编码序列,病毒滴度为1.2×10<'10>pfu/mL.转染HEK293细胞后荧光显微镜下观察到CFP的表达,Western blot检测可见4-1BBL蛋白的正确表达.结论 人41BBL基因重组腺病毒载体的成功构建和在HEK293细胞中的表达,为下一步将其应用于前列腺癌的免疫治疗奠定了基础.
目的 體外構建含有人4-IBBL基因的重組腺病毒載體,併檢測其在HEK293細胞中的錶達.方法 設計一對含有Sfil酶切位點的4-1BBL因上下遊引物,以質粒pCR4-TOP0-4-1BBL為模闆,通過PCR擴增穫得4-1BBL基因全序列.片段迴收後經酶切處理,連接到穿梭質粒pShuttle-CMV-EGFP上,穫得重組穿梭質粒pShuttle-ECFP-4-1BBL.經Sfil酶切、PCR及插入片段測序鑒定正確後,將其用I-Ceul和I-Scel雙酶切處理,轉移到pAdxsi載體上,得到pAdxsi-GFP-4-1BBL病毒質粒,PCR鑒定正確後,經HEK293細胞包裝成複製缺陷型腺病毒Ad-4-1BBL,通過觀察綠色熒光蛋白(GFP)的錶達,Western blot檢測目的 基因人4-1BBL的錶達.結果 酶切鑒定和序列分析證實,重組腺病毒質粒含有人4-1BBL全長cDNA編碼序列,病毒滴度為1.2×10<'10>pfu/mL.轉染HEK293細胞後熒光顯微鏡下觀察到CFP的錶達,Western blot檢測可見4-1BBL蛋白的正確錶達.結論 人41BBL基因重組腺病毒載體的成功構建和在HEK293細胞中的錶達,為下一步將其應用于前列腺癌的免疫治療奠定瞭基礎.
목적 체외구건함유인4-IBBL기인적중조선병독재체,병검측기재HEK293세포중적표체.방법 설계일대함유Sfil매절위점적4-1BBL인상하유인물,이질립pCR4-TOP0-4-1BBL위모판,통과PCR확증획득4-1BBL기인전서렬.편단회수후경매절처리,련접도천사질립pShuttle-CMV-EGFP상,획득중조천사질립pShuttle-ECFP-4-1BBL.경Sfil매절、PCR급삽입편단측서감정정학후,장기용I-Ceul화I-Scel쌍매절처리,전이도pAdxsi재체상,득도pAdxsi-GFP-4-1BBL병독질립,PCR감정정학후,경HEK293세포포장성복제결함형선병독Ad-4-1BBL,통과관찰록색형광단백(GFP)적표체,Western blot검측목적 기인인4-1BBL적표체.결과 매절감정화서렬분석증실,중조선병독질립함유인4-1BBL전장cDNA편마서렬,병독적도위1.2×10<'10>pfu/mL.전염HEK293세포후형광현미경하관찰도CFP적표체,Western blot검측가견4-1BBL단백적정학표체.결론 인41BBL기인중조선병독재체적성공구건화재HEK293세포중적표체,위하일보장기응용우전렬선암적면역치료전정료기출.
