生物技术通讯
生物技術通訊
생물기술통신
LETTERS IN BIOTECHNOLOGY
2008年
3期
328-331
,共4页
侯剀%白雪源%陈香美%冯哲%傅博
侯剴%白雪源%陳香美%馮哲%傅博
후개%백설원%진향미%풍철%부박
二羧酸转运蛋白%三羧酸循环%肾小管%亚细胞定位%连接效率
二羧痠轉運蛋白%三羧痠循環%腎小管%亞細胞定位%連接效率
이최산전운단백%삼최산순배%신소관%아세포정위%련접효솔
目的:克隆大鼠高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白(SDCT2)的全长cDNA,并明确其在肾小管上皮细胞内的定位表达情况.方法:从大鼠肾组织中提取总RNA,用带有8肽FLAG标签的PCR引物通过RT-PCR技术扩增出SDCT2全长基因并测序,将其插入真核表达载体中构建SDCT2真核表达载体,然后将它们转染到肾小管上皮细胞LLC-PK1中表达,并用激光共聚焦显微镜观察该蛋白的亚细胞定位情况.结果:扩增出2 kb的SDCT2全长基因,Westem blot表明SDCT2基因在LLC-PK1细胞中得到了正确的表达;共聚焦显微镜分析显示正常SDCT2蛋白主要定位于细胞膜上,与生物信息学的预测结果一致;为了比较不同连接温度对重组DNA连接效率的影响,观察了3种连接温度下的转化效率,结果显示温度循环法的连接效率明显比其他2种常规连接温度要高.结论:高亲和力钠依赖二羧酸转运蛋白全长基因被成功克隆,其主要表达于肾小管上皮细胞膜上.
目的:剋隆大鼠高親和力鈉依賴二羧痠轉運蛋白(SDCT2)的全長cDNA,併明確其在腎小管上皮細胞內的定位錶達情況.方法:從大鼠腎組織中提取總RNA,用帶有8肽FLAG標籤的PCR引物通過RT-PCR技術擴增齣SDCT2全長基因併測序,將其插入真覈錶達載體中構建SDCT2真覈錶達載體,然後將它們轉染到腎小管上皮細胞LLC-PK1中錶達,併用激光共聚焦顯微鏡觀察該蛋白的亞細胞定位情況.結果:擴增齣2 kb的SDCT2全長基因,Westem blot錶明SDCT2基因在LLC-PK1細胞中得到瞭正確的錶達;共聚焦顯微鏡分析顯示正常SDCT2蛋白主要定位于細胞膜上,與生物信息學的預測結果一緻;為瞭比較不同連接溫度對重組DNA連接效率的影響,觀察瞭3種連接溫度下的轉化效率,結果顯示溫度循環法的連接效率明顯比其他2種常規連接溫度要高.結論:高親和力鈉依賴二羧痠轉運蛋白全長基因被成功剋隆,其主要錶達于腎小管上皮細胞膜上.
목적:극륭대서고친화력납의뢰이최산전운단백(SDCT2)적전장cDNA,병명학기재신소관상피세포내적정위표체정황.방법:종대서신조직중제취총RNA,용대유8태FLAG표첨적PCR인물통과RT-PCR기술확증출SDCT2전장기인병측서,장기삽입진핵표체재체중구건SDCT2진핵표체재체,연후장타문전염도신소관상피세포LLC-PK1중표체,병용격광공취초현미경관찰해단백적아세포정위정황.결과:확증출2 kb적SDCT2전장기인,Westem blot표명SDCT2기인재LLC-PK1세포중득도료정학적표체;공취초현미경분석현시정상SDCT2단백주요정위우세포막상,여생물신식학적예측결과일치;위료비교불동련접온도대중조DNA련접효솔적영향,관찰료3충련접온도하적전화효솔,결과현시온도순배법적련접효솔명현비기타2충상규련접온도요고.결론:고친화력납의뢰이최산전운단백전장기인피성공극륭,기주요표체우신소관상피세포막상.
