CAJ | 학술논문

根据极大螺旋藻(Spirulina maxima)藻蓝蛋白α亚基的生物合成途径,利用PCR技术从极大螺旋藻基因组DNA中克隆了与其生物合成相关的5个基因藻蓝蛋白α亚基蛋白基因(cpcA)、血红素氧化酶基因(hox1)、藻蓝素:铁硫蛋白氧化还原酶(pcyA)、藻蓝素裂合酶基因E(cpcE)和藻蓝素裂合酶基因F(cpcF),并将这些基因用相应的限制性内切酶酶切后,依次构建到表达载体pETDuet-1的两个外源基因表达盒内,转化Escherichia coli BL21(DE3),经氨苄青霉素抗性筛选,得到工程菌ZJGSU02.经测序确认,连接到pETDuet-1上的5个基因拼接正确.IPTG诱导后,工程菌培养液中的细胞呈现明显的蓝色,对照菌颜色没有发生变化.SDS-PAGE电泳结果显示,在21 kD处有一明显的条带.重组蛋白经锌离子溶液浸泡后,在紫外光激发下呈现桔色荧光.Western blot分析表明,重组蛋白能特异性地与6×His-tag单克隆抗体结合.通过吸收光谱和荧光光谱检测,发现重组蛋白最大吸收波长为623 nm,最大荧光发射波长为645.8 nm,与天然极大螺旋藻中藻蓝蛋白α亚基的最大吸收波长和最大荧光发射波长一致,以上结果表明极大螺旋藻藻蓝蛋白α亚基已在大肠杆菌中成功实现异源表达.该研究结果不仅为色基结合蛋白这类复杂蛋白在异源宿主系统中的表达提供新的思路和方法,而且也为探索在一个表达载体上构建和表达5个或5个以上的外源目的蛋白基因及其基因互作等方面的研究提供借鉴.
근거겁대라선조(Spirulina maxima)조람단백α아기적생물합성도경,이용PCR기술종겁대라선조기인조DNA중극륭료여기생물합성상관적5개기인조람단백α아기단백기인(cpcA)、혈홍소양화매기인(hox1)、조람소:철류단백양화환원매(pcyA)、조람소렬합매기인E(cpcE)화조람소렬합매기인F(cpcF),병장저사기인용상응적한제성내절매매절후,의차구건도표체재체pETDuet-1적량개외원기인표체합내,전화Escherichia coli BL21(DE3),경안변청매소항성사선,득도공정균ZJGSU02.경측서학인,련접도pETDuet-1상적5개기인병접정학.IPTG유도후,공정균배양액중적세포정현명현적람색,대조균안색몰유발생변화.SDS-PAGE전영결과현시,재21 kD처유일명현적조대.중조단백경자리자용액침포후,재자외광격발하정현길색형광.Western blot분석표명,중조단백능특이성지여6×His-tag단극륭항체결합.통과흡수광보화형광광보검측,발현중조단백최대흡수파장위623 nm,최대형광발사파장위645.8 nm,여천연겁대라선조중조람단백α아기적최대흡수파장화최대형광발사파장일치,이상결과표명겁대라선조조람단백α아기이재대장간균중성공실현이원표체.해연구결과불부위색기결합단백저류복잡단백재이원숙주계통중적표체제공신적사로화방법,이차야위탐색재일개표체재체상구건화표체5개혹5개이상적외원목적단백기인급기기인호작등방면적연구제공차감.