CAJ | 학술논문

通过对个别氨基酸突变的研究,获得了保持良好生物活性的长半衰期组织因子途径抑制因子(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)重组蛋白的有效途径.采用定点诱变和基因重组技术,首先在TFPI cDNA特定位点形成一个位点的沉默突变,以提高TFPI在毕赤酵母细胞内的表达量,此cDNA称为mTFPI.在此基础上,通过系列位点突变,形成3个羧基端突变体:m0TFPI、m1TFPI和m2TFPI.将上述4种TFPI cDNA与表达质粒pPic9连接,转染大肠杆菌,通过PCR和DNA测序确认重组质粒,转染酵母细胞GS115,甲醇诱导表达重组蛋白.采用层析方法纯化TFPI重组蛋白,用125I标记重组蛋白,静脉注射给药,比较四者在SD大鼠体内血浆代谢清除速度.用底物显色法测定重组蛋白抑制凝血因子Xa(Fxa)的活性,比较各株TFPI重组蛋白突变体在体内、体外对FXa的抑制作用及肝素对各株TFPI重组蛋白功能的影响.结果显示,相比野生型TFPI重组蛋(mTFPI)而言,3株羧基端突变体m0TFPI、m1TFPI、m2TFPI在SD大鼠体内血浆代谢清除时间均有不同程度延长,其生物代谢半衰期分别是mTFPI的1.5倍、1.9倍和大于2倍,与m-TFPI相比,3个rTFPI突变体在体内、体外抑制FXa的作用无明显减弱,与肝素的结合能力及协同能力也无明显减弱.结果表明,m0TFPI、m1TFPI和m2TFPI在生物半衰期得到明显延长的同时,仍保持良好的抑制Fxa的生物活性.
통과대개별안기산돌변적연구,획득료보지량호생물활성적장반쇠기조직인자도경억제인자(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)중조단백적유효도경.채용정점유변화기인중조기술,수선재TFPI cDNA특정위점형성일개위점적침묵돌변,이제고TFPI재필적효모세포내적표체량,차cDNA칭위mTFPI.재차기출상,통과계렬위점돌변,형성3개최기단돌변체:m0TFPI、m1TFPI화m2TFPI.장상술4충TFPI cDNA여표체질립pPic9련접,전염대장간균,통과PCR화DNA측서학인중조질립,전염효모세포GS115,갑순유도표체중조단백.채용층석방법순화TFPI중조단백,용125I표기중조단백,정맥주사급약,비교사자재SD대서체내혈장대사청제속도.용저물현색법측정중조단백억제응혈인자Xa(Fxa)적활성,비교각주TFPI중조단백돌변체재체내、체외대FXa적억제작용급간소대각주TFPI중조단백공능적영향.결과현시,상비야생형TFPI중조단(mTFPI)이언,3주최기단돌변체m0TFPI、m1TFPI、m2TFPI재SD대서체내혈장대사청제시간균유불동정도연장,기생물대사반쇠기분별시mTFPI적1.5배、1.9배화대우2배,여m-TFPI상비,3개rTFPI돌변체재체내、체외억제FXa적작용무명현감약,여간소적결합능력급협동능력야무명현감약.결과표명,m0TFPI、m1TFPI화m2TFPI재생물반쇠기득도명현연장적동시,잉보지량호적억제Fxa적생물활성.