中华结核和呼吸杂志
中華結覈和呼吸雜誌
중화결핵화호흡잡지
Chinese Journal of Tuberculosis and Respiratory Diseases
2005年
3期
164-168
,共5页
程璘令%李冰%涂洪斌%刘启才%冉丕鑫
程璘令%李冰%塗洪斌%劉啟纔%冉丕鑫
정린령%리빙%도홍빈%류계재%염비흠
谷氨酰-半胱氨酸连接酶%基因功能分析%氧化性应激%肺疾病,慢性阻塞性
穀氨酰-半胱氨痠連接酶%基因功能分析%氧化性應激%肺疾病,慢性阻塞性
곡안선-반광안산련접매%기인공능분석%양화성응격%폐질병,만성조새성
目的分析大鼠γ谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)催化亚单位(GCLC)基因5'端调控区域和相应转录因子的特性.方法克隆1 760 bp大鼠GCLC上游调控基因并构建含荧光素酶基因的报道载体GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切核酸酶Ⅲ将大鼠GCLC基因的5'端序列单向切成不同长度的缺失体,将所构建的GCLC-Luc及其11个缺失体转染大鼠肺泡上皮细胞,通过测量转染后细胞的荧光素酶活性确定该基因的调控区域,并通过转录因子分析软件分析出可能与这些调控区域结合的转录因子,最后通过电泳迁移率改变实验(EMSA)以明确该调控区的顺式元件和转录因子.结果实验成功地克隆出大鼠GCLC上游调控基因及其报道载体GCLC-Luc及GCLC-Luc的11个缺失体.将GCLC-Luc及其缺失体转染肺泡上皮细胞并分析荧光素酶活性:GCLC-Luc(-1 758/+2-Luc),缺失体1(-1 231/+2-Luc),缺失体2(-1 108/+2-Luc),缺失体3(-1 087/+2-Luc),缺失体4(-876/+2-Luc),缺失体5(-745/+2-Luc),缺失体6(-705/+2-Luc),缺失体8(-613/+2-Luc),缺失体9(-595/+2-Luc),缺失体10(-403/+2-Luc)和缺失体11(-111/+2-Luc)的荧光素酶值分别为(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(282 772±7 046)、(96 891±2 275)、(148 917±5 966)、(258 991±5 015)和(895±49)U.EMSA证实核因子1(NF-1)、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)能与-705～-613 bp区段的序列结合,活化蛋白1(AP-1)、核因子κB(NF-κB)能与-403～-111 bp区段的序列结合,上游刺激因子(USF)能与-745～-705 bp区段的序列结合.结论 GCLC基因的-403～-111 bp和-705～-613 bp区段属正调控区域,NF-1、C/EBP、AP-1、NF-κB等转录因子能与这些正调控区域结合并可能参与GCLC基因的表达调控;-745～-705 bp属负调控区域,USF能与该负调控区域的E-box元件结合,提示E-box与USF相互作用可能抑制GCLC基因的表达.
目的分析大鼠γ穀氨酰半胱氨痠閤成酶(γ-GCS)催化亞單位(GCLC)基因5'耑調控區域和相應轉錄因子的特性.方法剋隆1 760 bp大鼠GCLC上遊調控基因併構建含熒光素酶基因的報道載體GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),利用外切覈痠酶Ⅲ將大鼠GCLC基因的5'耑序列單嚮切成不同長度的缺失體,將所構建的GCLC-Luc及其11箇缺失體轉染大鼠肺泡上皮細胞,通過測量轉染後細胞的熒光素酶活性確定該基因的調控區域,併通過轉錄因子分析軟件分析齣可能與這些調控區域結閤的轉錄因子,最後通過電泳遷移率改變實驗(EMSA)以明確該調控區的順式元件和轉錄因子.結果實驗成功地剋隆齣大鼠GCLC上遊調控基因及其報道載體GCLC-Luc及GCLC-Luc的11箇缺失體.將GCLC-Luc及其缺失體轉染肺泡上皮細胞併分析熒光素酶活性:GCLC-Luc(-1 758/+2-Luc),缺失體1(-1 231/+2-Luc),缺失體2(-1 108/+2-Luc),缺失體3(-1 087/+2-Luc),缺失體4(-876/+2-Luc),缺失體5(-745/+2-Luc),缺失體6(-705/+2-Luc),缺失體8(-613/+2-Luc),缺失體9(-595/+2-Luc),缺失體10(-403/+2-Luc)和缺失體11(-111/+2-Luc)的熒光素酶值分彆為(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(282 772±7 046)、(96 891±2 275)、(148 917±5 966)、(258 991±5 015)和(895±49)U.EMSA證實覈因子1(NF-1)、CCAAT/增彊子結閤蛋白(C/EBP)能與-705～-613 bp區段的序列結閤,活化蛋白1(AP-1)、覈因子κB(NF-κB)能與-403～-111 bp區段的序列結閤,上遊刺激因子(USF)能與-745～-705 bp區段的序列結閤.結論 GCLC基因的-403～-111 bp和-705～-613 bp區段屬正調控區域,NF-1、C/EBP、AP-1、NF-κB等轉錄因子能與這些正調控區域結閤併可能參與GCLC基因的錶達調控;-745～-705 bp屬負調控區域,USF能與該負調控區域的E-box元件結閤,提示E-box與USF相互作用可能抑製GCLC基因的錶達.
목적분석대서γ곡안선반광안산합성매(γ-GCS)최화아단위(GCLC)기인5'단조공구역화상응전록인자적특성.방법극륭1 760 bp대서GCLC상유조공기인병구건함형광소매기인적보도재체GCLC-Luc(GCLC/pGL-3),이용외절핵산매Ⅲ장대서GCLC기인적5'단서렬단향절성불동장도적결실체,장소구건적GCLC-Luc급기11개결실체전염대서폐포상피세포,통과측량전염후세포적형광소매활성학정해기인적조공구역,병통과전록인자분석연건분석출가능여저사조공구역결합적전록인자,최후통과전영천이솔개변실험(EMSA)이명학해조공구적순식원건화전록인자.결과실험성공지극륭출대서GCLC상유조공기인급기보도재체GCLC-Luc급GCLC-Luc적11개결실체.장GCLC-Luc급기결실체전염폐포상피세포병분석형광소매활성:GCLC-Luc(-1 758/+2-Luc),결실체1(-1 231/+2-Luc),결실체2(-1 108/+2-Luc),결실체3(-1 087/+2-Luc),결실체4(-876/+2-Luc),결실체5(-745/+2-Luc),결실체6(-705/+2-Luc),결실체8(-613/+2-Luc),결실체9(-595/+2-Luc),결실체10(-403/+2-Luc)화결실체11(-111/+2-Luc)적형광소매치분별위(90 012±2 445)、(77 652±840)、(149 927±4 915)、(71 588±1 108)、(99 283±2 612)、(75 443±1 438)、(282 772±7 046)、(96 891±2 275)、(148 917±5 966)、(258 991±5 015)화(895±49)U.EMSA증실핵인자1(NF-1)、CCAAT/증강자결합단백(C/EBP)능여-705～-613 bp구단적서렬결합,활화단백1(AP-1)、핵인자κB(NF-κB)능여-403～-111 bp구단적서렬결합,상유자격인자(USF)능여-745～-705 bp구단적서렬결합.결론 GCLC기인적-403～-111 bp화-705～-613 bp구단속정조공구역,NF-1、C/EBP、AP-1、NF-κB등전록인자능여저사정조공구역결합병가능삼여GCLC기인적표체조공;-745～-705 bp속부조공구역,USF능여해부조공구역적E-box원건결합,제시E-box여USF상호작용가능억제GCLC기인적표체.
