中国血吸虫病防治杂志
中國血吸蟲病防治雜誌
중국혈흡충병방치잡지
CHINESE JOURNAL OF SCHISTOSOMIASIS CONTROL
2004年
4期
277-280
,共4页
沈玉娟%曹建平%刘述先%徐馀信%宋光承
瀋玉娟%曹建平%劉述先%徐馀信%宋光承
침옥연%조건평%류술선%서여신%송광승
日本血吸虫%肌动蛋白%PCR%T载体%测序
日本血吸蟲%肌動蛋白%PCR%T載體%測序
일본혈흡충%기동단백%PCR%T재체%측서
目的构建快速高效克隆PCR产物的克隆载体(T载体),并对日本血吸虫肌动蛋白全长编码基因PCR产物进行快速克隆.方法日本血吸虫肌蛋白全长编码基因的扩增采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.质粒pGEM5Zf (+)经限制性内切酶EcoR V 酶切,在仅含有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的PCR缓冲液中于70 ℃作用2 h,在每个片段的3'端加上一个脱氧胸苷(dT)碱基,构建成T载体.根据PCR扩增产物3'端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷(dA)原理,将扩增产物直接克隆入T载体并测序.结果阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析、PCR及DNA序列测定等均证实克隆获得成功,且效率很高.与曼氏血吸虫肌动蛋白比较,核苷酸和推断的氨基酸的同源性分别是92.5%和99.7%.结论构建的pGEM5Zf-T载体对日本血吸虫肌动蛋白编码基因的PCR产物直接克隆既经济、简便,又快速、高效,所构建的T载体由于在插入位点两侧具有pUC/M13测序引物序列,可直接测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列.所获得的日本血吸虫(大陆株)肌动蛋白编码基因与曼氏血吸虫有极高的同源性.
目的構建快速高效剋隆PCR產物的剋隆載體(T載體),併對日本血吸蟲肌動蛋白全長編碼基因PCR產物進行快速剋隆.方法日本血吸蟲肌蛋白全長編碼基因的擴增採用反轉錄-聚閤酶鏈反應(RT-PCR)方法.質粒pGEM5Zf (+)經限製性內切酶EcoR V 酶切,在僅含有脫氧胸苷三燐痠(dTTP)的PCR緩遲液中于70 ℃作用2 h,在每箇片段的3'耑加上一箇脫氧胸苷(dT)堿基,構建成T載體.根據PCR擴增產物3'耑存在一箇非模闆依賴的脫氧腺苷(dA)原理,將擴增產物直接剋隆入T載體併測序.結果暘性剋隆經瓊脂糖凝膠電泳、限製性酶切分析、PCR及DNA序列測定等均證實剋隆穫得成功,且效率很高.與曼氏血吸蟲肌動蛋白比較,覈苷痠和推斷的氨基痠的同源性分彆是92.5%和99.7%.結論構建的pGEM5Zf-T載體對日本血吸蟲肌動蛋白編碼基因的PCR產物直接剋隆既經濟、簡便,又快速、高效,所構建的T載體由于在插入位點兩側具有pUC/M13測序引物序列,可直接測定重組質粒中插入片段的覈苷痠序列.所穫得的日本血吸蟲(大陸株)肌動蛋白編碼基因與曼氏血吸蟲有極高的同源性.
목적구건쾌속고효극륭PCR산물적극륭재체(T재체),병대일본혈흡충기동단백전장편마기인PCR산물진행쾌속극륭.방법일본혈흡충기단백전장편마기인적확증채용반전록-취합매련반응(RT-PCR)방법.질립pGEM5Zf (+)경한제성내절매EcoR V 매절,재부함유탈양흉감삼린산(dTTP)적PCR완충액중우70 ℃작용2 h,재매개편단적3'단가상일개탈양흉감(dT)감기,구건성T재체.근거PCR확증산물3'단존재일개비모판의뢰적탈양선감(dA)원리,장확증산물직접극륭입T재체병측서.결과양성극륭경경지당응효전영、한제성매절분석、PCR급DNA서렬측정등균증실극륭획득성공,차효솔흔고.여만씨혈흡충기동단백비교,핵감산화추단적안기산적동원성분별시92.5%화99.7%.결론구건적pGEM5Zf-T재체대일본혈흡충기동단백편마기인적PCR산물직접극륭기경제、간편,우쾌속、고효,소구건적T재체유우재삽입위점량측구유pUC/M13측서인물서렬,가직접측정중조질립중삽입편단적핵감산서렬.소획득적일본혈흡충(대륙주)기동단백편마기인여만씨혈흡충유겁고적동원성.
