CAJ | 학술논문

大鼠agrin基因实时定量聚合酶链反应的检测方法
대서agrin기인실시정량취합매련반응적검측방법
Real-Time PCR method to detect rat agrin Mrna

万方数据

中国组织工程研究与临床康复中國組織工程研究與臨床康複 중국조직공정연구여림상강복
JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH
2008年 7期 1259-1263 ,共5页

郭阳%江新梅%郭会敏%刘永茂%王峰%施雨露%冯相伟%朱武飞%邢英琦%赵清石%马学玲%杨蕴天%杨绿

곽양%강신매%곽회민%류영무%왕봉%시우로%풍상위%주무비%형영기%조청석%마학령%양온천%양록

实时定量PCR%agrin基因%ACTB基因%大鼠%组织构建實時定量PCR%agrin基因%ACTB基因%大鼠%組織構建
실시정량PCR%agrin기인%ACTB기인%대서%조직구건

目的:agrin基因对神经肌肉接头的形成、维持起着决定作用,也对神经元轴突的形成、延长、维持有重要作用,其表达产物在机体内分布广泛.设计绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法,并检测其特异性、敏感性和可重复性.方法:实验于2007-04/11在吉林大学基础医学院三综合实验室和吉林大学第一医院传染科实验室完成.以Primer 3软件设计大鼠agrin基因、ACTB基因mRNA嵌合荧光实时定量聚合酶链反应检测引物,经检索Blast验证特异性,并以Primer 5设计构建agrin基因标准品引物.选择清洁级Wistar大鼠交配,获取3日龄乳鼠,取脑,获取mRNA、cDNA,常规反转录-聚合酶链反应获取agrin 554个碱基DNA片断.PCR填加T7启动子后,T7 RNA Polymerase合成agrin基因标准品,消化模板.分光光度计测定其浓度,1∶5倍比稀释3次;经反转录反应合成agrin基因cDNA标准品,测序验证特异性.以ACTB引物反转录cDNA,1∶5倍稀释3次,构建ACTB基因标准品.常规聚合酶链反应确定、优化反应条件.标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性,融解曲线验证检测方法的特异性,作重复性检测.结果:①agrin基因有意义链引物序列:GAA GGC CAG GTG CGA ATC A,反义链引物序列:CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G,内标:ACTB基因有意义链引物序列:GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA,反义链引物序列:GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG,优化反应条件:95 ℃变性5 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s.②agrin基因、ACTB基因标准品所获得的标准曲线确定实时定量聚合酶链反应标准曲线的相关性均＞ 0.95.③聚合酶链反应产物电泳、测序、实时定量聚合酶链反应融解曲线证明特异性高、重复性好、灵敏度达到精确定量要求.结论:绝对定量嵌合荧光法检测大鼠agrin基因mRNA的实时定量聚合酶链反应方法可以作为大鼠agrin基因mRNA检测的标准方法.
목적:agrin기인대신경기육접두적형성、유지기착결정작용,야대신경원축돌적형성、연장、유지유중요작용,기표체산물재궤체내분포엄범.설계절대정량감합형광법검측대서agrin기인mRNA적실시정량취합매련반응방법,병검측기특이성、민감성화가중복성.방법:실험우2007-04/11재길림대학기출의학원삼종합실험실화길림대학제일의원전염과실험실완성.이Primer 3연건설계대서agrin기인、ACTB기인mRNA감합형광실시정량취합매련반응검측인물,경검색Blast험증특이성,병이Primer 5설계구건agrin기인표준품인물.선택청길급Wistar대서교배,획취3일령유서,취뇌,획취mRNA、cDNA,상규반전록-취합매련반응획취agrin 554개감기DNA편단.PCR전가T7계동자후,T7 RNA Polymerase합성agrin기인표준품,소화모판.분광광도계측정기농도,1∶5배비희석3차;경반전록반응합성agrin기인cDNA표준품,측서험증특이성.이ACTB인물반전록cDNA,1∶5배희석3차,구건ACTB기인표준품.상규취합매련반응학정、우화반응조건.표준곡선학정실시정량취합매련반응표준곡선적상관성,융해곡선험증검측방법적특이성,작중복성검측.결과:①agrin기인유의의련인물서렬:GAA GGC CAG GTG CGA ATC A,반의련인물서렬:CAC AGG TAG CAG TGG AGC CAA G,내표:ACTB기인유의의련인물서렬:GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA,반의련인물서렬:GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG,우화반응조건:95 ℃변성5 s,60 ℃퇴화20 s,72 ℃연신20 s.②agrin기인、ACTB기인표준품소획득적표준곡선학정실시정량취합매련반응표준곡선적상관성균＞ 0.95.③취합매련반응산물전영、측서、실시정량취합매련반응융해곡선증명특이성고、중복성호、령민도체도정학정량요구.결론:절대정량감합형광법검측대서agrin기인mRNA적실시정량취합매련반응방법가이작위대서agrin기인mRNA검측적표준방법.