江苏大学学报（医学版）
江囌大學學報（醫學版）
강소대학학보（의학판）
JOURNAL OF JIANGSU UNIVERSITY (MEDICINE EDITION)
2006年
2期
93-96
,共4页
贾伟%杭赛宇%史宁%周迎会%吴士良
賈偉%杭賽宇%史寧%週迎會%吳士良
가위%항새우%사저%주영회%오사량
多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2%原核表达%GST融合蛋白%谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析%酶活检测
多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉移酶2%原覈錶達%GST融閤蛋白%穀胱甘肽-瓊脂糖親和層析%酶活檢測
다태:N-을선안기반유당전이매2%원핵표체%GST융합단백%곡광감태-경지당친화층석%매활검측
目的:以人类多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(ppGalNAc-T2)为研究对象,利用载体pGEX-5X-3在大肠杆菌(E. Coli)BL21中原核表达其编码序列,并对表达产物进行纯化、复性及酶活检测.方法:首先利用PCR技术从克隆载体pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全长编码序列,将其亚克隆至原核表达载体pGEX-5X-3,形成重组表达质粒pGEX-5X-3/T2.重组质粒转化大肠杆菌DH5α,测序鉴定后转化BL21,异丙基硫代半乳糖(IPTG)诱导后,表达产物为主要以包涵体形式存在的融合蛋白.对其复性后用谷胱甘肽-琼脂糖(Glutathione-Sepharose)4B亲和层析柱进行纯化.然后根据ppGalNAc-T2的催化功能,设计底物,建立酶促反应体系,利用高效液相色谱(HPLC)进行酶活分析.结果:成功构建了原核表达重组载体pGEX-5X-3/T2,通过蛋白质电泳检测到分子量约为90 kD的融合蛋白的表达,利用亲和层析得到纯化的酶蛋白,并经Western印迹得以验证.反应后体系上柱洗脱后出现酶促反应的产物洗脱峰.结论:成功构建了重组表达载体pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全长编码序列被成功表达、纯化及复性,检测到具有酶活性.
目的:以人類多肽:N-乙酰氨基半乳糖轉移酶2(ppGalNAc-T2)為研究對象,利用載體pGEX-5X-3在大腸桿菌(E. Coli)BL21中原覈錶達其編碼序列,併對錶達產物進行純化、複性及酶活檢測.方法:首先利用PCR技術從剋隆載體pDONR201-T2得到ppGalNAc-T2全長編碼序列,將其亞剋隆至原覈錶達載體pGEX-5X-3,形成重組錶達質粒pGEX-5X-3/T2.重組質粒轉化大腸桿菌DH5α,測序鑒定後轉化BL21,異丙基硫代半乳糖(IPTG)誘導後,錶達產物為主要以包涵體形式存在的融閤蛋白.對其複性後用穀胱甘肽-瓊脂糖(Glutathione-Sepharose)4B親和層析柱進行純化.然後根據ppGalNAc-T2的催化功能,設計底物,建立酶促反應體繫,利用高效液相色譜(HPLC)進行酶活分析.結果:成功構建瞭原覈錶達重組載體pGEX-5X-3/T2,通過蛋白質電泳檢測到分子量約為90 kD的融閤蛋白的錶達,利用親和層析得到純化的酶蛋白,併經Western印跡得以驗證.反應後體繫上柱洗脫後齣現酶促反應的產物洗脫峰.結論:成功構建瞭重組錶達載體pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2全長編碼序列被成功錶達、純化及複性,檢測到具有酶活性.
목적:이인류다태:N-을선안기반유당전이매2(ppGalNAc-T2)위연구대상,이용재체pGEX-5X-3재대장간균(E. Coli)BL21중원핵표체기편마서렬,병대표체산물진행순화、복성급매활검측.방법:수선이용PCR기술종극륭재체pDONR201-T2득도ppGalNAc-T2전장편마서렬,장기아극륭지원핵표체재체pGEX-5X-3,형성중조표체질립pGEX-5X-3/T2.중조질립전화대장간균DH5α,측서감정후전화BL21,이병기류대반유당(IPTG)유도후,표체산물위주요이포함체형식존재적융합단백.대기복성후용곡광감태-경지당(Glutathione-Sepharose)4B친화층석주진행순화.연후근거ppGalNAc-T2적최화공능,설계저물,건립매촉반응체계,이용고효액상색보(HPLC)진행매활분석.결과:성공구건료원핵표체중조재체pGEX-5X-3/T2,통과단백질전영검측도분자량약위90 kD적융합단백적표체,이용친화층석득도순화적매단백,병경Western인적득이험증.반응후체계상주세탈후출현매촉반응적산물세탈봉.결론:성공구건료중조표체재체pGEX-5X-3/T2,ppGalNAc-T2전장편마서렬피성공표체、순화급복성,검측도구유매활성.
