CAJ | 학술논문

目的:建立人脐静脉内皮及内皮下间充质干细胞体外培养和扩增的方法,探讨其生物学特性,建立间充质干细胞体外培养扩增体系.方法:实验于2006-04/2006-09在辽宁医学院解剖学实验室完成.解剖细胞培养室为无菌百级培养间.正常健康产妇顺产或剖宫产的新生儿脐带由辽宁医学院附属第一医院提供,产妇及其家属均知情同意,并经医院伦理委员会批准.实验方法:①体外分离和培养贴壁细胞:无菌条件下取正常健康产妇分娩或剖宫产脐带,将其用预热PBS充分洗涤去血渍后,从脐静脉一端插入留置针,用预热PBS冲净静脉腔血后,用止血钳夹闭另一端,注入经预热至37 ℃的Ⅰ型胶原酶,置于37 ℃水浴箱中消化,30 min后放出胶原酶,并用PBS冲洗血管腔,收集消化液和冲洗液,400 r/min离心10 min,吸弃上清液,重悬于M199培养基(含体积分数为0.15的胎牛血清,2 mmol/L谷氨z酰胺,2 μg/L碱性成纤维细胞生长因子,100 U/mL青霉素,100 U/mL链霉素).以5×108 L-1密度接种于6孔培养板中,置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,48 h后全量换液,以后每3 d全量换液.待细胞80%融合时,0.25%胰酶消化,按1×108 L-1传代培养.②间充质干细胞生长曲线的测定:取传代培养细胞,按2×107L-1密度接种于24孔培养板内,每天取3孔,将细胞消化计数,连测8 d,绘制间充质干细胞生长曲线.③间充质干细胞表面抗原检测:在24孔塑料培养板内放置无菌的盖玻片,每孔中种植108 L-1第2代细胞悬液1 mL.采用免疫细胞化学方法进行细胞表面抗原检测.结果:①间充质干细胞的形态学观察:接种的细胞48 h后细胞完全贴壁生长,其镜下形态有呈椭圆形、多角形的内皮细胞以及呈梭形的成纤维样细胞,有的形成漩涡状生长的集落.②间充质干细胞生长曲线的分析:传代培养的潜伏期约为24～36 h,细胞倍增时间约为30～36 h,对数增殖期约为二三天,对数增殖期后第5天进入平台期.③间充质干细胞表面抗原特性:免疫细胞化学分析结果显示,间充质干细胞表面抗原cd166、cd44阳性,而vWF阴性,说明分离获得的细胞具有间充质干细胞的特点.结论:所建立的分离和培养方法可获取人脐静脉黏附细胞中一组独特的细胞群,具有间充质干细胞的生物学特性. 目的:建立人臍靜脈內皮及內皮下間充質榦細胞體外培養和擴增的方法,探討其生物學特性,建立間充質榦細胞體外培養擴增體繫.方法:實驗于2006-04/2006-09在遼寧醫學院解剖學實驗室完成.解剖細胞培養室為無菌百級培養間.正常健康產婦順產或剖宮產的新生兒臍帶由遼寧醫學院附屬第一醫院提供,產婦及其傢屬均知情同意,併經醫院倫理委員會批準.實驗方法:①體外分離和培養貼壁細胞:無菌條件下取正常健康產婦分娩或剖宮產臍帶,將其用預熱PBS充分洗滌去血漬後,從臍靜脈一耑插入留置針,用預熱PBS遲淨靜脈腔血後,用止血鉗夾閉另一耑,註入經預熱至37 ℃的Ⅰ型膠原酶,置于37 ℃水浴箱中消化,30 min後放齣膠原酶,併用PBS遲洗血管腔,收集消化液和遲洗液,400 r/min離心10 min,吸棄上清液,重懸于M199培養基(含體積分數為0.15的胎牛血清,2 mmol/L穀氨z酰胺,2 μg/L堿性成纖維細胞生長因子,100 U/mL青黴素,100 U/mL鏈黴素).以5×108 L-1密度接種于6孔培養闆中,置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2飽和濕度培養箱中培養,48 h後全量換液,以後每3 d全量換液.待細胞80%融閤時,0.25%胰酶消化,按1×108 L-1傳代培養.②間充質榦細胞生長麯線的測定:取傳代培養細胞,按2×107L-1密度接種于24孔培養闆內,每天取3孔,將細胞消化計數,連測8 d,繪製間充質榦細胞生長麯線.③間充質榦細胞錶麵抗原檢測:在24孔塑料培養闆內放置無菌的蓋玻片,每孔中種植108 L-1第2代細胞懸液1 mL.採用免疫細胞化學方法進行細胞錶麵抗原檢測.結果:①間充質榦細胞的形態學觀察:接種的細胞48 h後細胞完全貼壁生長,其鏡下形態有呈橢圓形、多角形的內皮細胞以及呈梭形的成纖維樣細胞,有的形成漩渦狀生長的集落.②間充質榦細胞生長麯線的分析:傳代培養的潛伏期約為24～36 h,細胞倍增時間約為30～36 h,對數增殖期約為二三天,對數增殖期後第5天進入平檯期.③間充質榦細胞錶麵抗原特性:免疫細胞化學分析結果顯示,間充質榦細胞錶麵抗原cd166、cd44暘性,而vWF陰性,說明分離穫得的細胞具有間充質榦細胞的特點.結論:所建立的分離和培養方法可穫取人臍靜脈黏附細胞中一組獨特的細胞群,具有間充質榦細胞的生物學特性.
목적:건립인제정맥내피급내피하간충질간세포체외배양화확증적방법,탐토기생물학특성,건립간충질간세포체외배양확증체계.방법:실험우2006-04/2006-09재료녕의학원해부학실험실완성.해부세포배양실위무균백급배양간.정상건강산부순산혹부궁산적신생인제대유료녕의학원부속제일의원제공,산부급기가속균지정동의,병경의원윤리위원회비준.실험방법:①체외분리화배양첩벽세포:무균조건하취정상건강산부분면혹부궁산제대,장기용예열PBS충분세조거혈지후,종제정맥일단삽입류치침,용예열PBS충정정맥강혈후,용지혈겸협폐령일단,주입경예열지37 ℃적Ⅰ형효원매,치우37 ℃수욕상중소화,30 min후방출효원매,병용PBS충세혈관강,수집소화액화충세액,400 r/min리심10 min,흡기상청액,중현우M199배양기(함체적분수위0.15적태우혈청,2 mmol/L곡안z선알,2 μg/L감성성섬유세포생장인자,100 U/mL청매소,100 U/mL련매소).이5×108 L-1밀도접충우6공배양판중,치우37 ℃、체적분수위0.05적CO2포화습도배양상중배양,48 h후전량환액,이후매3 d전량환액.대세포80%융합시,0.25%이매소화,안1×108 L-1전대배양.②간충질간세포생장곡선적측정:취전대배양세포,안2×107L-1밀도접충우24공배양판내,매천취3공,장세포소화계수,련측8 d,회제간충질간세포생장곡선.③간충질간세포표면항원검측:재24공소료배양판내방치무균적개파편,매공중충식108 L-1제2대세포현액1 mL.채용면역세포화학방법진행세포표면항원검측.결과:①간충질간세포적형태학관찰:접충적세포48 h후세포완전첩벽생장,기경하형태유정타원형、다각형적내피세포이급정사형적성섬유양세포,유적형성선와상생장적집락.②간충질간세포생장곡선적분석:전대배양적잠복기약위24～36 h,세포배증시간약위30～36 h,대수증식기약위이삼천,대수증식기후제5천진입평태기.③간충질간세포표면항원특성:면역세포화학분석결과현시,간충질간세포표면항원cd166、cd44양성,이vWF음성,설명분리획득적세포구유간충질간세포적특점.결론:소건립적분리화배양방법가획취인제정맥점부세포중일조독특적세포군,구유간충질간세포적생물학특성.