中国急救医学
中國急救醫學
중국급구의학
CHINESE JOURNAL OF CRITICAL CARE MEDICINE
2012年
5期
421-426,彩1
,共7页
刘红升%赵晓东%苏琴%党伟%果应菲%袁晓玲%姚咏明
劉紅升%趙曉東%囌琴%黨偉%果應菲%袁曉玲%姚詠明
류홍승%조효동%소금%당위%과응비%원효령%요영명
类胰岛素生长因子-I(IGF-Ⅰ)%慢病毒表达载体%RNA干扰
類胰島素生長因子-I(IGF-Ⅰ)%慢病毒錶達載體%RNA榦擾
류이도소생장인자-I(IGF-Ⅰ)%만병독표체재체%RNA간우
目的 设计并筛选人IGF-I有效RNA干扰片段,构建IGF-I-siRNA慢病毒表达载体.方法 对人IGF-I基因编码区分析、筛选序列4条,阴性对照序列1条.与pGCL-GFP质粒重组后,转染大肠杆菌感受态细胞.阳性克隆经过鉴定后得到正确重组子,制备编码慢病毒颗粒的重组病毒质粒及其两种辅助包装原件载体质粒,共转染293T 细胞,体外直接感染表达IGF-I的人血管平滑肌细胞.通过用Realtime-PCR检验干扰效果.结果 ①成功地合成四条编码发夹siRNA序列的单链DNA,并将其克隆到pGCSIL-GFP载体中,构建重组质粒PscSI-1、2、3、4,及无关基因的重组质粒PscNC,酶切鉴定和测序证实载体构建成功;②Realtime-PCR检测IGF-I的mRNA表达,发现重组质粒PscSI-1转染人血管平滑肌细胞后IGF-I mRNA表达最低,重组质粒PscNC转染组细胞内IGF-I mRNA的表达量与空白对照的水平接近(P>0.05).结论 成功构建了小的发夹式IGF-I慢病毒表达载体.在人IGF-I序列位点1010～1028 bp、序列为ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌细胞中实现对人IGF-I基因表达的有效沉默.
目的 設計併篩選人IGF-I有效RNA榦擾片段,構建IGF-I-siRNA慢病毒錶達載體.方法 對人IGF-I基因編碼區分析、篩選序列4條,陰性對照序列1條.與pGCL-GFP質粒重組後,轉染大腸桿菌感受態細胞.暘性剋隆經過鑒定後得到正確重組子,製備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及其兩種輔助包裝原件載體質粒,共轉染293T 細胞,體外直接感染錶達IGF-I的人血管平滑肌細胞.通過用Realtime-PCR檢驗榦擾效果.結果 ①成功地閤成四條編碼髮夾siRNA序列的單鏈DNA,併將其剋隆到pGCSIL-GFP載體中,構建重組質粒PscSI-1、2、3、4,及無關基因的重組質粒PscNC,酶切鑒定和測序證實載體構建成功;②Realtime-PCR檢測IGF-I的mRNA錶達,髮現重組質粒PscSI-1轉染人血管平滑肌細胞後IGF-I mRNA錶達最低,重組質粒PscNC轉染組細胞內IGF-I mRNA的錶達量與空白對照的水平接近(P>0.05).結論 成功構建瞭小的髮夾式IGF-I慢病毒錶達載體.在人IGF-I序列位點1010～1028 bp、序列為ACCTTGTCTAAGTGGTTTA可以在人血管平滑肌細胞中實現對人IGF-I基因錶達的有效沉默.
목적 설계병사선인IGF-I유효RNA간우편단,구건IGF-I-siRNA만병독표체재체.방법 대인IGF-I기인편마구분석、사선서렬4조,음성대조서렬1조.여pGCL-GFP질립중조후,전염대장간균감수태세포.양성극륭경과감정후득도정학중조자,제비편마만병독과립적중조병독질립급기량충보조포장원건재체질립,공전염293T 세포,체외직접감염표체IGF-I적인혈관평활기세포.통과용Realtime-PCR검험간우효과.결과 ①성공지합성사조편마발협siRNA서렬적단련DNA,병장기극륭도pGCSIL-GFP재체중,구건중조질립PscSI-1、2、3、4,급무관기인적중조질립PscNC,매절감정화측서증실재체구건성공;②Realtime-PCR검측IGF-I적mRNA표체,발현중조질립PscSI-1전염인혈관평활기세포후IGF-I mRNA표체최저,중조질립PscNC전염조세포내IGF-I mRNA적표체량여공백대조적수평접근(P>0.05).결론 성공구건료소적발협식IGF-I만병독표체재체.재인IGF-I서렬위점1010～1028 bp、서렬위ACCTTGTCTAAGTGGTTTA가이재인혈관평활기세포중실현대인IGF-I기인표체적유효침묵.
