中国临床康复
中國臨床康複
중국림상강복
CHINESE JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATION
2006年
17期
79-81,插5
,共4页
曲福军%侯宜%周余来%刘丽玲%颜炜群%杨同书%侯立中
麯福軍%侯宜%週餘來%劉麗玲%顏煒群%楊同書%侯立中
곡복군%후의%주여래%류려령%안위군%양동서%후립중
生物医学工程%骨形态发生蛋白质类/分析%转基因%软骨细胞%遗传载体%质粒
生物醫學工程%骨形態髮生蛋白質類/分析%轉基因%軟骨細胞%遺傳載體%質粒
생물의학공정%골형태발생단백질류/분석%전기인%연골세포%유전재체%질립
目的:将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中,观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达.方法:实验于2003-08/2004-08在哈尔滨兽医研究所完成.①选取清洁级健康成年家兔1只,兔膝关节软骨切碎后取2.0～2.5 kg软骨组织,进行关节软骨细胞的分离与培养.②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物,复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg.用含G418400 mg/L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒的软骨细胞,显微镜观察细胞的形态及活性.③软骨细胞转染后7 d和28 d,分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达.结果:①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况:家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶/Ⅱ型胶原酶进行消化,能使细胞与细胞外基质很好地分离.接种24 h,部分细胞开始贴壁生长,72 h后分裂增殖,7 d时细胞融合率为90%～100%.贴壁初期细胞呈圆形或三角形,以三角形为主,每7 d传代1次.②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况:转染后的软骨细胞用G418筛选,4 d转染效率约15%,阳性克隆细胞七八天融合率约为90%.G418连续筛选28 d,阳性克隆细胞仍然存活,细胞融合率为100%.未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞,G418筛选4d时细胞全部死亡.③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果:聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,结果在1.3kb处可见DNA条带,作为对照的软骨细胞未见此DNA条带.少转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果:在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18 000的电泳条带.⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果:可见相对分子质量约为18 000的特异性条带.⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果:转染7,28 d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光,未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达.⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果:转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7,28 d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色,未转染的软骨细胞未见BMP7表达.结论:用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞,BMP7在关节软骨细胞中获得表达,为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础.
目的:將重組pcDNA3.1-BMP7真覈錶達載體轉染至培養的兔膝關節軟骨細胞中,觀察BMP7基因在兔關節軟骨細胞中的錶達.方法:實驗于2003-08/2004-08在哈爾濱獸醫研究所完成.①選取清潔級健康成年傢兔1隻,兔膝關節軟骨切碎後取2.0～2.5 kg軟骨組織,進行關節軟骨細胞的分離與培養.②脂質體與pcDNA3.1-BMP7 DNA質粒形成脂質體-DNA質粒複閤物,複閤物的最佳比例為脂質體10μL、pcDNA3.1-BMP7質粒4μg.用含G418400 mg/L的正常培養液篩選轉染pcDNA3.1-BMP7 DNA質粒的軟骨細胞,顯微鏡觀察細胞的形態及活性.③軟骨細胞轉染後7 d和28 d,分彆用聚閤酶鏈式反應、十二烷基磺痠鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western blot、免疫熒光、原位雜交檢測等方法測定BMP7蛋白在軟骨細胞中的錶達.結果:①傢兔膝關節軟骨細胞的分離與培養情況:傢兔膝關節軟骨切碎後用胰蛋白酶/Ⅱ型膠原酶進行消化,能使細胞與細胞外基質很好地分離.接種24 h,部分細胞開始貼壁生長,72 h後分裂增殖,7 d時細胞融閤率為90%～100%.貼壁初期細胞呈圓形或三角形,以三角形為主,每7 d傳代1次.②脂質體介導下pcDNA3.1-BMP7質粒轉染兔軟骨細胞情況:轉染後的軟骨細胞用G418篩選,4 d轉染效率約15%,暘性剋隆細胞七八天融閤率約為90%.G418連續篩選28 d,暘性剋隆細胞仍然存活,細胞融閤率為100%.未轉染pcDNA3.1-BMP7質粒的細胞,G418篩選4d時細胞全部死亡.③轉染後兔軟骨細胞聚閤酶鏈式反應檢測結果:聚閤酶鏈式反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離,結果在1.3kb處可見DNA條帶,作為對照的軟骨細胞未見此DNA條帶.少轉染後軟骨細胞BMP7蛋白錶達電泳檢測結果:在十二烷基磺痠鈉-聚丙烯酰胺凝膠上可見相對分子質量約為18 000的電泳條帶.⑤轉染後軟骨細胞BMP7蛋白錶達的Western blot檢測結果:可見相對分子質量約為18 000的特異性條帶.⑥轉染後軟骨細胞蛋白錶達的免疫熒光檢測結果:轉染7,28 d的軟骨細胞覈週圍均可見綠色熒光,未轉染的軟骨細胞未見BMP7蛋白錶達.⑦轉染後軟骨細胞原位雜交檢測結果:轉染pcDNA3.1-BMP7質粒且G418篩選7,28 d的軟骨細胞細胞覈週圍均呈黃褐色,未轉染的軟骨細胞未見BMP7錶達.結論:用脂質體將pcDNA3.1-BMP7 DNA質粒轉染至兔關節軟骨細胞,BMP7在關節軟骨細胞中穫得錶達,為軟骨損傷的基因治療及用作種子細胞構建組織工程軟骨奠定實驗基礎.
목적:장중조pcDNA3.1-BMP7진핵표체재체전염지배양적토슬관절연골세포중,관찰BMP7기인재토관절연골세포중적표체.방법:실험우2003-08/2004-08재합이빈수의연구소완성.①선취청길급건강성년가토1지,토슬관절연골절쇄후취2.0～2.5 kg연골조직,진행관절연골세포적분리여배양.②지질체여pcDNA3.1-BMP7 DNA질립형성지질체-DNA질립복합물,복합물적최가비례위지질체10μL、pcDNA3.1-BMP7질립4μg.용함G418400 mg/L적정상배양액사선전염pcDNA3.1-BMP7 DNA질립적연골세포,현미경관찰세포적형태급활성.③연골세포전염후7 d화28 d,분별용취합매련식반응、십이완기광산납-취병희선알응효전영、Western blot、면역형광、원위잡교검측등방법측정BMP7단백재연골세포중적표체.결과:①가토슬관절연골세포적분리여배양정황:가토슬관절연골절쇄후용이단백매/Ⅱ형효원매진행소화,능사세포여세포외기질흔호지분리.접충24 h,부분세포개시첩벽생장,72 h후분렬증식,7 d시세포융합솔위90%～100%.첩벽초기세포정원형혹삼각형,이삼각형위주,매7 d전대1차.②지질체개도하pcDNA3.1-BMP7질립전염토연골세포정황:전염후적연골세포용G418사선,4 d전염효솔약15%,양성극륭세포칠팔천융합솔약위90%.G418련속사선28 d,양성극륭세포잉연존활,세포융합솔위100%.미전염pcDNA3.1-BMP7질립적세포,G418사선4d시세포전부사망.③전염후토연골세포취합매련식반응검측결과:취합매련식반응산물진행경지당응효전영분리,결과재1.3kb처가견DNA조대,작위대조적연골세포미견차DNA조대.소전염후연골세포BMP7단백표체전영검측결과:재십이완기광산납-취병희선알응효상가견상대분자질량약위18 000적전영조대.⑤전염후연골세포BMP7단백표체적Western blot검측결과:가견상대분자질량약위18 000적특이성조대.⑥전염후연골세포단백표체적면역형광검측결과:전염7,28 d적연골세포핵주위균가견록색형광,미전염적연골세포미견BMP7단백표체.⑦전염후연골세포원위잡교검측결과:전염pcDNA3.1-BMP7질립차G418사선7,28 d적연골세포세포핵주위균정황갈색,미전염적연골세포미견BMP7표체.결론:용지질체장pcDNA3.1-BMP7 DNA질립전염지토관절연골세포,BMP7재관절연골세포중획득표체,위연골손상적기인치료급용작충자세포구건조직공정연골전정실험기출.
