CAJ | 학술논문

目的:优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽(BSP)与HLA-A*0203重链胞外域的融合蛋白(HLA-A*0203-BSP),并制备负载HLA-A*0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3596-604的四聚体( HLA-A*0203/SVR).方法:以HLA-A*0203-BSP原核表达载体转化E.coli BL21(DE3)菌株,优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达.通过稀释法复性可溶性HLA-A*0203/SVR单体,然后以BirA对其进行生物素化,并以阴离子交换树脂纯化.将纯化的HLA-A*0203/SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4:1的比例混合形成四聚体,通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性.结果:当IPTG的浓度为0.4 mmol/L,于37℃诱导过夜后,融合蛋白的表达最多.该重组蛋白相对分子质量(Mr)为34000,与HLA-A*0203-BSP的理论Mr相一致.该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分,约占菌体总蛋白的30%.负载抗原肽的可溶性HLA-A*0203/SVR单体是在同时存在HLA-A*0203-BSP、β2微球蛋白及HLA-A*0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得.该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4: 1的比例混合后即形成四聚体.流式细胞术(FCM)分析证实,该四聚体具有与HLA-A2+供者特异性CTL结合的活性.结论:HLA-A*0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达.以此蛋白制备的HLA-A*0203/SVR四聚体具有与HLAA2+供者特异性CTL结合的活性,为研究HLA-A*0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础.
목적:우화유도조건대비량표체생물소화매BirA저물태(BSP)여HLA-A*0203중련포외역적융합단백(HLA-A*0203-BSP),병제비부재HLA-A*0203한제성EB병독항원태EBNA3596-604적사취체( HLA-A*0203/SVR).방법:이HLA-A*0203-BSP원핵표체재체전화E.coli BL21(DE3)균주,우화유도조건진행대비량중조단백적표체.통과희석법복성가용성HLA-A*0203/SVR단체,연후이BirA대기진행생물소화,병이음리자교환수지순화.장순화적HLA-A*0203/SVR단체여형광소표기적련친화소안4:1적비례혼합형성사취체,통과대특이성CTL진행염색험증기결합활성.결과:당IPTG적농도위0.4 mmol/L,우37℃유도과야후,융합단백적표체최다.해중조단백상대분자질량(Mr)위34000,여HLA-A*0203-BSP적이론Mr상일치.해중조단백이포함체형식존재우침정부분,약점균체총단백적30%.부재항원태적가용성HLA-A*0203/SVR단체시재동시존재HLA-A*0203-BSP、β2미구단백급HLA-A*0203한제성항원태SVR적정황하통과희석법복성이획득.해단체생물소화병순화후여형광소표기적련친화소안4: 1적비례혼합후즉형성사취체.류식세포술(FCM)분석증실,해사취체구유여HLA-A2+공자특이성CTL결합적활성.결론:HLA-A*0203-BSP융합단백재우화조건하획득고효표체.이차단백제비적HLA-A*0203/SVR사취체구유여HLAA2+공자특이성CTL결합적활성,위연구HLA-A*0203개체EB병독특이성CTL적면역응답타하료기출.