军事医学科学院院刊
軍事醫學科學院院刊
군사의학과학원원간
BULLETIN OF THE ACADEMY OF MILITARY MEDICAL SCIENCES
2010年
6期
547-550
,共4页
刘大伟%郭燕红%孙忠科%黄留玉%袁静
劉大偉%郭燕紅%孫忠科%黃留玉%袁靜
류대위%곽연홍%손충과%황류옥%원정
长双歧杆菌NCC2705%BL0034蛋白%表达纯化%ATP结合
長雙歧桿菌NCC2705%BL0034蛋白%錶達純化%ATP結閤
장쌍기간균NCC2705%BL0034단백%표체순화%ATP결합
目的 克隆长双歧杆菌NCC2705中ATP结合蛋白BL0034的基因,利用大肠杆菌表达并纯化GST-BL0034融合蛋白,测定其结合ATP的活性.方法 以长双歧杆菌NCC2705基因组为模板PCR扩增BL0034基因,双酶切后连接到pGEX-4T-1表达载体上,转入大肠杆菌BL21中表达;用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂对可溶性的GST-BL0034融合蛋白进行纯化,并用Western 印迹验证.结果 将BL0034基因克隆至质粒pGEX-4T-1,构建表达载体pGEX-4T-1-BL0034. BL0034经0.05 mmoL/L IPTG诱导,16℃过夜表达,SDS-PAGE可见相对分子质量约为82×103的可溶性表达条带;亲和纯化GST-BL0034,Western 印迹结果为阳性.对纯化后的融合BL0033蛋白结合ATP的能力进行了定量测定,每毫克BL0034蛋白能结合约40 nmol/L ATP.结论 成功克隆了BL0034蛋白的基因,表达并纯化GST-BL0034蛋白,证实了BL0034与ATP具有较强的结合能力,为进一步研究长双歧杆菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定了基础,为阐明其在果糖ABC转运系统中如何通过水解ATP产生能量提供了前提.
目的 剋隆長雙歧桿菌NCC2705中ATP結閤蛋白BL0034的基因,利用大腸桿菌錶達併純化GST-BL0034融閤蛋白,測定其結閤ATP的活性.方法 以長雙歧桿菌NCC2705基因組為模闆PCR擴增BL0034基因,雙酶切後連接到pGEX-4T-1錶達載體上,轉入大腸桿菌BL21中錶達;用穀胱甘肽-Sepharose 4B樹脂對可溶性的GST-BL0034融閤蛋白進行純化,併用Western 印跡驗證.結果 將BL0034基因剋隆至質粒pGEX-4T-1,構建錶達載體pGEX-4T-1-BL0034. BL0034經0.05 mmoL/L IPTG誘導,16℃過夜錶達,SDS-PAGE可見相對分子質量約為82×103的可溶性錶達條帶;親和純化GST-BL0034,Western 印跡結果為暘性.對純化後的融閤BL0033蛋白結閤ATP的能力進行瞭定量測定,每毫剋BL0034蛋白能結閤約40 nmol/L ATP.結論 成功剋隆瞭BL0034蛋白的基因,錶達併純化GST-BL0034蛋白,證實瞭BL0034與ATP具有較彊的結閤能力,為進一步研究長雙歧桿菌NCC2705 BL0034蛋白的功能奠定瞭基礎,為闡明其在果糖ABC轉運繫統中如何通過水解ATP產生能量提供瞭前提.
목적 극륭장쌍기간균NCC2705중ATP결합단백BL0034적기인,이용대장간균표체병순화GST-BL0034융합단백,측정기결합ATP적활성.방법 이장쌍기간균NCC2705기인조위모판PCR확증BL0034기인,쌍매절후련접도pGEX-4T-1표체재체상,전입대장간균BL21중표체;용곡광감태-Sepharose 4B수지대가용성적GST-BL0034융합단백진행순화,병용Western 인적험증.결과 장BL0034기인극륭지질립pGEX-4T-1,구건표체재체pGEX-4T-1-BL0034. BL0034경0.05 mmoL/L IPTG유도,16℃과야표체,SDS-PAGE가견상대분자질량약위82×103적가용성표체조대;친화순화GST-BL0034,Western 인적결과위양성.대순화후적융합BL0033단백결합ATP적능력진행료정량측정,매호극BL0034단백능결합약40 nmol/L ATP.결론 성공극륭료BL0034단백적기인,표체병순화GST-BL0034단백,증실료BL0034여ATP구유교강적결합능력,위진일보연구장쌍기간균NCC2705 BL0034단백적공능전정료기출,위천명기재과당ABC전운계통중여하통과수해ATP산생능량제공료전제.
