中国医学科学院学报
中國醫學科學院學報
중국의학과학원학보
ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE
2003年
3期
312-315
,共4页
刘澎%王一%杨仁池%顾洁%蔡英林%韩忠朝
劉澎%王一%楊仁池%顧潔%蔡英林%韓忠朝
류팽%왕일%양인지%고길%채영림%한충조
凝血酶敏感蛋白1 AdEasy System 基因治疗 腺病毒
凝血酶敏感蛋白1 AdEasy System 基因治療 腺病毒
응혈매민감단백1 AdEasy System 기인치료 선병독
目的构建人凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)抗血管生成片段重组腺病毒.方法采用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增编码TSP1抗血管生成活性片段(TSP1f)的cDNA序列,并将其克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV上,以线性化重组穿梭载体与超螺旋腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,进行同源重组并酶切鉴定筛选正确重组子,用线性化重组质粒转染人胚肾293细胞,制备重组腺病毒ADV-TSP1 f,最后以PCR及Western blot方法鉴定TSP1抗血管生成片段的表达.结果细菌内同源重组共获得43个卡那霉素抗性克隆,经酶切鉴定表明其中直径最小的10个均为正确重组子,该重组质粒转染293细胞所获得的重组腺病毒可高效表达TSP1抗血管生成片段,纯化后病毒滴度为1.0×1011 pfu/mL.结论细菌内同源重组法构建重组腺病毒高效快捷,所获得的ADV-TSP1f可进一步应用于抗肿瘤血管生成的基因治疗研究.
目的構建人凝血酶敏感蛋白1(thrombospondin1,TSP1)抗血管生成片段重組腺病毒.方法採用RT-PCR方法從正常人外週血單箇覈細胞擴增編碼TSP1抗血管生成活性片段(TSP1f)的cDNA序列,併將其剋隆至穿梭質粒pShuttle-CMV上,以線性化重組穿梭載體與超螺鏇腺病毒骨架質粒pAdEasy-1共轉化大腸桿菌BJ5183,進行同源重組併酶切鑒定篩選正確重組子,用線性化重組質粒轉染人胚腎293細胞,製備重組腺病毒ADV-TSP1 f,最後以PCR及Western blot方法鑒定TSP1抗血管生成片段的錶達.結果細菌內同源重組共穫得43箇卡那黴素抗性剋隆,經酶切鑒定錶明其中直徑最小的10箇均為正確重組子,該重組質粒轉染293細胞所穫得的重組腺病毒可高效錶達TSP1抗血管生成片段,純化後病毒滴度為1.0×1011 pfu/mL.結論細菌內同源重組法構建重組腺病毒高效快捷,所穫得的ADV-TSP1f可進一步應用于抗腫瘤血管生成的基因治療研究.
목적구건인응혈매민감단백1(thrombospondin1,TSP1)항혈관생성편단중조선병독.방법채용RT-PCR방법종정상인외주혈단개핵세포확증편마TSP1항혈관생성활성편단(TSP1f)적cDNA서렬,병장기극륭지천사질립pShuttle-CMV상,이선성화중조천사재체여초라선선병독골가질립pAdEasy-1공전화대장간균BJ5183,진행동원중조병매절감정사선정학중조자,용선성화중조질립전염인배신293세포,제비중조선병독ADV-TSP1 f,최후이PCR급Western blot방법감정TSP1항혈관생성편단적표체.결과세균내동원중조공획득43개잡나매소항성극륭,경매절감정표명기중직경최소적10개균위정학중조자,해중조질립전염293세포소획득적중조선병독가고효표체TSP1항혈관생성편단,순화후병독적도위1.0×1011 pfu/mL.결론세균내동원중조법구건중조선병독고효쾌첩,소획득적ADV-TSP1f가진일보응용우항종류혈관생성적기인치료연구.
