中国免疫学杂志
中國免疫學雜誌
중국면역학잡지
CHINESE JOURNAL OF IMMUNOLOGY
2012年
10期
926-929
,共4页
张晨光%王辉%牛志国%时慧森%尹明梅%王雪平%胡亚会%郑融融%孔海瑞%陈仪%胡丽华
張晨光%王輝%牛誌國%時慧森%尹明梅%王雪平%鬍亞會%鄭融融%孔海瑞%陳儀%鬍麗華
장신광%왕휘%우지국%시혜삼%윤명매%왕설평%호아회%정융융%공해서%진의%호려화
HMGB1调控基因%Jurkat细胞%报告基因%稳定转染
HMGB1調控基因%Jurkat細胞%報告基因%穩定轉染
HMGB1조공기인%Jurkat세포%보고기인%은정전염
目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1 (HMGB1) 基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株,为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础.方法:以Jurkat细胞基因组为模板,PCR扩增3′端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),均将其连入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5a.对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆,然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒,成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1～8号质粒).利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞,48小时后加入终浓度600 μg/ml的G418进行药物加压筛选,20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序,依次命名为NEO细胞和1~8号细胞).通过检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1).结果:HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒.8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致.HMGB1-T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配.成功构建了不同长度的3′端固定的pGL3-HMGB1-luc报告基因.pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc稳定转染至Jurkat细胞后,成功构建了NEO细胞和稳定细胞株HJ1~8,其荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490.结论:构建的HMGB1调控序列报告基因和HJ稳定细胞株为找寻有意义的HMGB1调控区域,以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定了基础.
目的:構建不同長度的高遷移率族蛋白1 (HMGB1) 基因調控序列的真覈錶達載體及其穩定錶達的Jurkat細胞株,為研究HMGB1基因在白血病髮病機製建立基礎.方法:以Jurkat細胞基因組為模闆,PCR擴增3′耑固定的8箇不同長度的HMGB1調控基因(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),均將其連入pMD18-T載體,併轉化大腸桿菌DH5a.對氨芐青黴素篩選的暘性剋隆進行擴增、質粒抽提,應用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切鑒定和DNA測序穫得序列正確的暘性剋隆,然後再經酶切連入pGL3-neo-luc質粒,成功構建HMGB1基因調控序列報告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至長順序依次命名為1～8號質粒).利用脂質體介導的方法將不同長度的pGL3-HMGB1-luc質粒和pGL3-neo-luc質粒分彆轉染至Jurkat細胞,48小時後加入終濃度600 μg/ml的G418進行藥物加壓篩選,20天後得到有效轉染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc載體的Jurkat細胞株(按有無HMGB1調控基因及其由短至長順序,依次命名為NEO細胞和1~8號細胞).通過檢測熒光素酶活性,驗證構建的Jurkat穩定細胞株(Jurkat-HMGB1).結果:HMGB1調控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位點之間構建齣3號質粒;HMGB1調控序列1016 bp定嚮剋隆至3號質粒的KpnⅠ和XhoⅠ位點之間,成功構建齣8號質粒;將166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp長度的HMGB1調控基因定嚮剋隆至3號質粒的KpnⅠ和HindⅢ位點之間,分彆構建齣1號、2號、4號、5號、6號、7號質粒.8箇質粒均經KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ雙酶切,電泳顯示條帶與擴增的HMGB1調控序列長度一緻.HMGB1-T載體的DNA測序結果與NCBI提供序列完全匹配.成功構建瞭不同長度的3′耑固定的pGL3-HMGB1-luc報告基因.pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc穩定轉染至Jurkat細胞後,成功構建瞭NEO細胞和穩定細胞株HJ1~8,其熒光素酶髮光值分彆為:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490.結論:構建的HMGB1調控序列報告基因和HJ穩定細胞株為找尋有意義的HMGB1調控區域,以及後期研究HMGB1基因在成人T淋巴細胞白血病中的髮病機製奠定瞭基礎.
목적:구건불동장도적고천이솔족단백1 (HMGB1) 기인조공서렬적진핵표체재체급기은정표체적Jurkat세포주,위연구HMGB1기인재백혈병발병궤제건립기출.방법:이Jurkat세포기인조위모판,PCR확증3′단고정적8개불동장도적HMGB1조공기인(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),균장기련입pMD18-T재체,병전화대장간균DH5a.대안변청매소사선적양성극륭진행확증、질립추제,응용KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ쌍매절감정화DNA측서획득서렬정학적양성극륭,연후재경매절련입pGL3-neo-luc질립,성공구건HMGB1기인조공서렬보고기인pGL3-HMGB1-luc(안유단지장순서의차명명위1～8호질립).이용지질체개도적방법장불동장도적pGL3-HMGB1-luc질립화pGL3-neo-luc질립분별전염지Jurkat세포,48소시후가입종농도600 μg/ml적G418진행약물가압사선,20천후득도유효전염pGL3-HMGB1-luc급pGL3-neo-luc재체적Jurkat세포주(안유무HMGB1조공기인급기유단지장순서,의차명명위NEO세포화1~8호세포).통과검측형광소매활성,험증구건적Jurkat은정세포주(Jurkat-HMGB1).결과:HMGB1조공기인성공삽입도pGL3-neo-luc적XhoⅠ화HindⅢ위점지간구건출3호질립;HMGB1조공서렬1016 bp정향극륭지3호질립적KpnⅠ화XhoⅠ위점지간,성공구건출8호질립;장166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp장도적HMGB1조공기인정향극륭지3호질립적KpnⅠ화HindⅢ위점지간,분별구건출1호、2호、4호、5호、6호、7호질립.8개질립균경KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ쌍매절,전영현시조대여확증적HMGB1조공서렬장도일치.HMGB1-T재체적DNA측서결과여NCBI제공서렬완전필배.성공구건료불동장도적3′단고정적pGL3-HMGB1-luc보고기인.pGL3-neo-luc화pGL3-HMGB1-luc은정전염지Jurkat세포후,성공구건료NEO세포화은정세포주HJ1~8,기형광소매발광치분별위:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490.결론:구건적HMGB1조공서렬보고기인화HJ은정세포주위조심유의의적HMGB1조공구역,이급후기연구HMGB1기인재성인T림파세포백혈병중적발병궤제전정료기출.
