江苏农业学报
江囌農業學報
강소농업학보
JIANGSU JOURNAL OF AGRICULTURAL SCIENCES
2012年
5期
1083-1087
,共5页
丰秀静%田石%蒋进%孟春花%茆达干%曹少先
豐秀靜%田石%蔣進%孟春花%茆達榦%曹少先
봉수정%전석%장진%맹춘화%묘체간%조소선
转基因通用载体%共表达序列%新霉素磷酸转移酶基因%增强型绿色荧光蛋白质基因%LoxP
轉基因通用載體%共錶達序列%新黴素燐痠轉移酶基因%增彊型綠色熒光蛋白質基因%LoxP
전기인통용재체%공표체서렬%신매소린산전이매기인%증강형록색형광단백질기인%LoxP
为了构建通用型动物转基因载体,以pBluescriptⅡKS+为基础,根据标记基因所含酶切位点,设计改造多克隆位点,插入从pTARGET载体中扩增的SV40启动子及新霉素磷酸转移酶基因(Neo),其下游插入共表达序列、增强型绿色荧光蛋白质基因(EGFP)及SV40 poly A,并在SV40启动子上游和SV40 poly A下游各添加一个同向的LoxP位点,构建成通用载体pNIGFP,标记基因上游拥有XhoⅠ、SalⅠ、SacⅡ多克隆位点,下游拥有Nhe Ⅰ、ClaⅠ、SacⅠ位点.酶切鉴定和测序表明pNIGFP构建正确.pNIGFP脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,荧光显微镜下观察到EGFP高表达.遗传霉素(G418)筛选表明,Neo基因表达正常,山羊胎儿成纤维细胞的最适筛选浓度为600μg/ml.pNIGFP可利用G418进行抗性筛选,还可通过EGFP表达对外源基因的整合进行实时跟踪,另外,该载体具有LoxP位点,外源基因整合后可用Cre重组酶去除标记基因,具有高效、方便、安全的特点.
為瞭構建通用型動物轉基因載體,以pBluescriptⅡKS+為基礎,根據標記基因所含酶切位點,設計改造多剋隆位點,插入從pTARGET載體中擴增的SV40啟動子及新黴素燐痠轉移酶基因(Neo),其下遊插入共錶達序列、增彊型綠色熒光蛋白質基因(EGFP)及SV40 poly A,併在SV40啟動子上遊和SV40 poly A下遊各添加一箇同嚮的LoxP位點,構建成通用載體pNIGFP,標記基因上遊擁有XhoⅠ、SalⅠ、SacⅡ多剋隆位點,下遊擁有Nhe Ⅰ、ClaⅠ、SacⅠ位點.酶切鑒定和測序錶明pNIGFP構建正確.pNIGFP脂質體法轉染山羊胎兒成纖維細胞,熒光顯微鏡下觀察到EGFP高錶達.遺傳黴素(G418)篩選錶明,Neo基因錶達正常,山羊胎兒成纖維細胞的最適篩選濃度為600μg/ml.pNIGFP可利用G418進行抗性篩選,還可通過EGFP錶達對外源基因的整閤進行實時跟蹤,另外,該載體具有LoxP位點,外源基因整閤後可用Cre重組酶去除標記基因,具有高效、方便、安全的特點.
위료구건통용형동물전기인재체,이pBluescriptⅡKS+위기출,근거표기기인소함매절위점,설계개조다극륭위점,삽입종pTARGET재체중확증적SV40계동자급신매소린산전이매기인(Neo),기하유삽입공표체서렬、증강형록색형광단백질기인(EGFP)급SV40 poly A,병재SV40계동자상유화SV40 poly A하유각첨가일개동향적LoxP위점,구건성통용재체pNIGFP,표기기인상유옹유XhoⅠ、SalⅠ、SacⅡ다극륭위점,하유옹유Nhe Ⅰ、ClaⅠ、SacⅠ위점.매절감정화측서표명pNIGFP구건정학.pNIGFP지질체법전염산양태인성섬유세포,형광현미경하관찰도EGFP고표체.유전매소(G418)사선표명,Neo기인표체정상,산양태인성섬유세포적최괄사선농도위600μg/ml.pNIGFP가이용G418진행항성사선,환가통과EGFP표체대외원기인적정합진행실시근종,령외,해재체구유LoxP위점,외원기인정합후가용Cre중조매거제표기기인,구유고효、방편、안전적특점.
