山东医药
山東醫藥
산동의약
SHANDONG MEDICAL JOURNAL
2009年
13期
11-13
,共3页
黄前川%李津婴%曹军皓%丁进亚%周虹%许艳群
黃前川%李津嬰%曹軍皓%丁進亞%週虹%許豔群
황전천%리진영%조군호%정진아%주홍%허염군
铁效应元件%亚铁鳌合酶%短发夹RNA
鐵效應元件%亞鐵鼇閤酶%短髮夾RNA
철효응원건%아철오합매%단발협RNA
目的 利用含红色荧光报告基因(DsRed)的pGCsi-U6/Neo/DsRed/质粒构建干扰人红系特异的γ-氨基-6-酮戊酸合成酶(eALAS)基因表达的短发夹RNA(shRNA)表达载体,并进行活性鉴定.方法 根据GenBank中eALAS的序列,设计3条表达shRNA的互补DNA序列,分别克隆至质粒载体pGCsi-U6/Neo/DsRed中构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株扩增后,提取质粒测序分析,以相同的方法构建并鉴定eALAS基因的真核表达载体pEGFP-N1-eALAS;将3种pGCsi-U6/Neo/DsRed/eALAS-shRNA分别与pEGFP-N1-eALAS共转染HEK293细胞株,通过流式细胞仪检测pEGFF-N1-eALAS融合蛋白的荧光强度,选择最佳RNA干扰(RNAi)靶点,并在基因和蛋白水平检测eALAS的表达,进一步验证最佳RNAi靶点的敲减效率.结果 经测序,模板序列与设计序列完全正确,最佳RNAi靶点敲减效率达72.45%,eALAS在基因和蛋白水平显著下降.结论 成功构建了eALAS特异性RNAi表达载体,为下一步研究铁效应元件eALAS在铁代谢异常所致红系统疾病的机制奠定了基础.
目的 利用含紅色熒光報告基因(DsRed)的pGCsi-U6/Neo/DsRed/質粒構建榦擾人紅繫特異的γ-氨基-6-酮戊痠閤成酶(eALAS)基因錶達的短髮夾RNA(shRNA)錶達載體,併進行活性鑒定.方法 根據GenBank中eALAS的序列,設計3條錶達shRNA的互補DNA序列,分彆剋隆至質粒載體pGCsi-U6/Neo/DsRed中構建重組質粒,轉化大腸桿菌DH5α菌株擴增後,提取質粒測序分析,以相同的方法構建併鑒定eALAS基因的真覈錶達載體pEGFP-N1-eALAS;將3種pGCsi-U6/Neo/DsRed/eALAS-shRNA分彆與pEGFP-N1-eALAS共轉染HEK293細胞株,通過流式細胞儀檢測pEGFF-N1-eALAS融閤蛋白的熒光彊度,選擇最佳RNA榦擾(RNAi)靶點,併在基因和蛋白水平檢測eALAS的錶達,進一步驗證最佳RNAi靶點的敲減效率.結果 經測序,模闆序列與設計序列完全正確,最佳RNAi靶點敲減效率達72.45%,eALAS在基因和蛋白水平顯著下降.結論 成功構建瞭eALAS特異性RNAi錶達載體,為下一步研究鐵效應元件eALAS在鐵代謝異常所緻紅繫統疾病的機製奠定瞭基礎.
목적 이용함홍색형광보고기인(DsRed)적pGCsi-U6/Neo/DsRed/질립구건간우인홍계특이적γ-안기-6-동무산합성매(eALAS)기인표체적단발협RNA(shRNA)표체재체,병진행활성감정.방법 근거GenBank중eALAS적서렬,설계3조표체shRNA적호보DNA서렬,분별극륭지질립재체pGCsi-U6/Neo/DsRed중구건중조질립,전화대장간균DH5α균주확증후,제취질립측서분석,이상동적방법구건병감정eALAS기인적진핵표체재체pEGFP-N1-eALAS;장3충pGCsi-U6/Neo/DsRed/eALAS-shRNA분별여pEGFP-N1-eALAS공전염HEK293세포주,통과류식세포의검측pEGFF-N1-eALAS융합단백적형광강도,선택최가RNA간우(RNAi)파점,병재기인화단백수평검측eALAS적표체,진일보험증최가RNAi파점적고감효솔.결과 경측서,모판서렬여설계서렬완전정학,최가RNAi파점고감효솔체72.45%,eALAS재기인화단백수평현저하강.결론 성공구건료eALAS특이성RNAi표체재체,위하일보연구철효응원건eALAS재철대사이상소치홍계통질병적궤제전정료기출.
