中国比较医学杂志
中國比較醫學雜誌
중국비교의학잡지
CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE
2012年
1期
28-33
,共6页
张梅英%徐影琪%王惟%赵越%杨葳%于萌%郭晓冲%秦英%郑志红
張梅英%徐影琪%王惟%趙越%楊葳%于萌%郭曉遲%秦英%鄭誌紅
장매영%서영기%왕유%조월%양위%우맹%곽효충%진영%정지홍
DJ-1%NIH3T3细胞%帕金森%凋亡
DJ-1%NIH3T3細胞%帕金森%凋亡
DJ-1%NIH3T3세포%파금삼%조망
目的 构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,为研究DJ-1M26I突变与细胞增殖、凋亡的关系及建立转基因动物模型奠定基础.方法 采用突变试剂盒将DJ-1蛋白第26位氨基酸进行突变,分别构建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,并采用脂质体介导的方法分别将其转染入NIH3T3细胞,500 μg/mL G418压力筛选稳定克隆,对2种转染细胞在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行鉴定,采用MTT染色方法和AnnexinV-FITC试剂盒进行转染阳性克隆细胞的细胞活力与细胞凋亡检测.结果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重组质粒转染NIH3T3细胞经G418筛选后,PCR方法检测分别获得1个和3个阳性细胞克隆,RT-PCR及western blot方法进行DJ-1 -His基因表达检测,结果均证明外源插入基因的表达,MTT实验结果初步证明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率低于正常NIH3T3细胞组(P＜0.05),转染DJ-1基因的NIH3T3阳性细胞组细胞增殖速率与正常NIH3T3细胞相比无明显差别；细胞凋亡检测表明转染DJ-1M26I基因的NIH3T3阳性细胞组细胞凋亡率高于正常NIH3T3细胞,转染DJ-1基因的NIH3Ｔ3阳性细胞组细胞凋亡率低于正常NIH3T3细胞(P＜0.05).结论 成功构建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重组表达载体,成功筛选出稳定表达人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3细胞.DJ-1M26I基因突变更易导致NIH3T3细胞的凋亡.
目的 構建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重組錶達載體,為研究DJ-1M26I突變與細胞增殖、凋亡的關繫及建立轉基因動物模型奠定基礎.方法 採用突變試劑盒將DJ-1蛋白第26位氨基痠進行突變,分彆構建pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重組錶達載體,併採用脂質體介導的方法分彆將其轉染入NIH3T3細胞,500 μg/mL G418壓力篩選穩定剋隆,對2種轉染細胞在DNA水平、RNA水平和蛋白質水平進行鑒定,採用MTT染色方法和AnnexinV-FITC試劑盒進行轉染暘性剋隆細胞的細胞活力與細胞凋亡檢測.結果 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I重組質粒轉染NIH3T3細胞經G418篩選後,PCR方法檢測分彆穫得1箇和3箇暘性細胞剋隆,RT-PCR及western blot方法進行DJ-1 -His基因錶達檢測,結果均證明外源插入基因的錶達,MTT實驗結果初步證明轉染DJ-1M26I基因的NIH3T3暘性細胞組細胞增殖速率低于正常NIH3T3細胞組(P＜0.05),轉染DJ-1基因的NIH3T3暘性細胞組細胞增殖速率與正常NIH3T3細胞相比無明顯差彆；細胞凋亡檢測錶明轉染DJ-1M26I基因的NIH3T3暘性細胞組細胞凋亡率高于正常NIH3T3細胞,轉染DJ-1基因的NIH3Ｔ3暘性細胞組細胞凋亡率低于正常NIH3T3細胞(P＜0.05).結論 成功構建pcDNA3.1/myc-His- DJ-1和pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I重組錶達載體,成功篩選齣穩定錶達人DJ-1及DJ-1M26I的NIH3T3細胞.DJ-1M26I基因突變更易導緻NIH3T3細胞的凋亡.
목적 구건pcDNA3.1/myc-His-DJ-1화pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I중조표체재체,위연구DJ-1M26I돌변여세포증식、조망적관계급건립전기인동물모형전정기출.방법 채용돌변시제합장DJ-1단백제26위안기산진행돌변,분별구건pcDNA3.1/myc-His-DJ-1화pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I중조표체재체,병채용지질체개도적방법분별장기전염입NIH3T3세포,500 μg/mL G418압력사선은정극륭,대2충전염세포재DNA수평、RNA수평화단백질수평진행감정,채용MTT염색방법화AnnexinV-FITC시제합진행전염양성극륭세포적세포활력여세포조망검측.결과 pcDNA3.1/myc-His-DJ-1화pcDNA3.1/myc-His-DJ-1 M26I중조질립전염NIH3T3세포경G418사선후,PCR방법검측분별획득1개화3개양성세포극륭,RT-PCR급western blot방법진행DJ-1 -His기인표체검측,결과균증명외원삽입기인적표체,MTT실험결과초보증명전염DJ-1M26I기인적NIH3T3양성세포조세포증식속솔저우정상NIH3T3세포조(P＜0.05),전염DJ-1기인적NIH3T3양성세포조세포증식속솔여정상NIH3T3세포상비무명현차별；세포조망검측표명전염DJ-1M26I기인적NIH3T3양성세포조세포조망솔고우정상NIH3T3세포,전염DJ-1기인적NIH3Ｔ3양성세포조세포조망솔저우정상NIH3T3세포(P＜0.05).결론 성공구건pcDNA3.1/myc-His- DJ-1화pcDNA3.1/myc-His-DJ-1M26I중조표체재체,성공사선출은정표체인DJ-1급DJ-1M26I적NIH3T3세포.DJ-1M26I기인돌변경역도치NIH3T3세포적조망.
