癌变·畸变·突变
癌變·畸變·突變
암변·기변·돌변
CARCINOGENSES,TERATOGENSIS AND MUTAGENESIS
2001年
4期
277
,共1页
RDPCR%LMPCR%p53基因%DNA损伤%地高辛标记探针
RDPCR%LMPCR%p53基因%DNA損傷%地高辛標記探針
RDPCR%LMPCR%p53기인%DNA손상%지고신표기탐침
目的：设计、建立并初步评价能检测特定基因DNA损伤的随机末端连接物依赖的PCR（Randomized Terminal Linker－Dependent PCR，RDPCR）新技术。方法：培养TK6细胞并提取基因组DNA。用PCR技术扩增186bp的p53基因外显子7，以凝胶回收纯化的扩增产物为模板，再进行新的PCR反应标记地高辛探针，标记探针被电泳和定量。用限制性内切酶AfaI完全消化基因组DNA建立损伤模型；经过p53基因外显子7的特异性引物P1重复直线延伸，与一带有3′随机粘性末端的双链公共连接物（Linker）在T4 DNA连接酶作用下连接后，用基因特异性引物P2和连接物引物经PCR指数扩增；琼脂糖电泳，真空转印至带正电荷的尼龙膜上，再与地高辛标记的探针杂交后显色。结果：p53基因外显子7的扩增条带清晰，特异。标记探针的电泳速度稍慢于未标记片段；定量为50 μg/μl。RDPCR结果表明，使用3′末端阻止的Linker可见在相应位置出现了清晰的目标带，而未阻止的由于Linker的自身连接显色信号微弱；灰度计量显示RDPCR的信号强度是传统的连接介导聚合酶链反应（Ligation－mediated Polymerase Chain Reaction，LMPCR）的7倍，但其背景稍高。结论：RDPCR是在LMPCR、单链连接PCR(Single-strand Ligation PCR，SLPCR）和末端转移酶依赖的PCR （Terminal transferase-dependent PCR，TDPCR）技术上设计的新的体外扩增技术，可以有效检测特定基因的DNA损伤。它可能克服LMPCR、SLPCR和TDPCR各自的缺陷，如应用局限、连接效率低和定位不精确等，更为灵敏、简便、快速和适用。结合Maxam-Gilbert化学测序技术，RDPCR还能在核酸序列水平检测特定基因的DNA损伤，包括DNA加合物、链断裂和氧化损伤等，有很好的应用前景。
目的：設計、建立併初步評價能檢測特定基因DNA損傷的隨機末耑連接物依賴的PCR（Randomized Terminal Linker－Dependent PCR，RDPCR）新技術。方法：培養TK6細胞併提取基因組DNA。用PCR技術擴增186bp的p53基因外顯子7，以凝膠迴收純化的擴增產物為模闆，再進行新的PCR反應標記地高辛探針，標記探針被電泳和定量。用限製性內切酶AfaI完全消化基因組DNA建立損傷模型；經過p53基因外顯子7的特異性引物P1重複直線延伸，與一帶有3′隨機粘性末耑的雙鏈公共連接物（Linker）在T4 DNA連接酶作用下連接後，用基因特異性引物P2和連接物引物經PCR指數擴增；瓊脂糖電泳，真空轉印至帶正電荷的尼龍膜上，再與地高辛標記的探針雜交後顯色。結果：p53基因外顯子7的擴增條帶清晰，特異。標記探針的電泳速度稍慢于未標記片段；定量為50 μg/μl。RDPCR結果錶明，使用3′末耑阻止的Linker可見在相應位置齣現瞭清晰的目標帶，而未阻止的由于Linker的自身連接顯色信號微弱；灰度計量顯示RDPCR的信號彊度是傳統的連接介導聚閤酶鏈反應（Ligation－mediated Polymerase Chain Reaction，LMPCR）的7倍，但其揹景稍高。結論：RDPCR是在LMPCR、單鏈連接PCR(Single-strand Ligation PCR，SLPCR）和末耑轉移酶依賴的PCR （Terminal transferase-dependent PCR，TDPCR）技術上設計的新的體外擴增技術，可以有效檢測特定基因的DNA損傷。它可能剋服LMPCR、SLPCR和TDPCR各自的缺陷，如應用跼限、連接效率低和定位不精確等，更為靈敏、簡便、快速和適用。結閤Maxam-Gilbert化學測序技術，RDPCR還能在覈痠序列水平檢測特定基因的DNA損傷，包括DNA加閤物、鏈斷裂和氧化損傷等，有很好的應用前景。
목적：설계、건립병초보평개능검측특정기인DNA손상적수궤말단련접물의뢰적PCR（Randomized Terminal Linker－Dependent PCR，RDPCR）신기술。방법：배양TK6세포병제취기인조DNA。용PCR기술확증186bp적p53기인외현자7，이응효회수순화적확증산물위모판，재진행신적PCR반응표기지고신탐침，표기탐침피전영화정량。용한제성내절매AfaI완전소화기인조DNA건립손상모형；경과p53기인외현자7적특이성인물P1중복직선연신，여일대유3′수궤점성말단적쌍련공공련접물（Linker）재T4 DNA련접매작용하련접후，용기인특이성인물P2화련접물인물경PCR지수확증；경지당전영，진공전인지대정전하적니룡막상，재여지고신표기적탐침잡교후현색。결과：p53기인외현자7적확증조대청석，특이。표기탐침적전영속도초만우미표기편단；정량위50 μg/μl。RDPCR결과표명，사용3′말단조지적Linker가견재상응위치출현료청석적목표대，이미조지적유우Linker적자신련접현색신호미약；회도계량현시RDPCR적신호강도시전통적련접개도취합매련반응（Ligation－mediated Polymerase Chain Reaction，LMPCR）적7배，단기배경초고。결론：RDPCR시재LMPCR、단련련접PCR(Single-strand Ligation PCR，SLPCR）화말단전이매의뢰적PCR （Terminal transferase-dependent PCR，TDPCR）기술상설계적신적체외확증기술，가이유효검측특정기인적DNA손상。타가능극복LMPCR、SLPCR화TDPCR각자적결함，여응용국한、련접효솔저화정위불정학등，경위령민、간편、쾌속화괄용。결합Maxam-Gilbert화학측서기술，RDPCR환능재핵산서렬수평검측특정기인적DNA손상，포괄DNA가합물、련단렬화양화손상등，유흔호적응용전경。
