生物化学与生物物理进展
生物化學與生物物理進展
생물화학여생물물리진전
PROGRESS IN BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS
2006年
1期
31-38
,共8页
谢轶%曾蔚%贾文祥%杨发龙%杨维青%程曦%康梅%王兰兰%张再容
謝軼%曾蔚%賈文祥%楊髮龍%楊維青%程晞%康梅%王蘭蘭%張再容
사질%증위%가문상%양발룡%양유청%정희%강매%왕란란%장재용
铜绿假单胞菌%数量感知系统%生物被膜%免疫原性
銅綠假單胞菌%數量感知繫統%生物被膜%免疫原性
동록가단포균%수량감지계통%생물피막%면역원성
Pseudomonas aeruginosa%quorum sensing system%biofilms%immunization
为探讨铜绿假单胞菌PAO1中lasR和rhlR基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应(PCR)方法扩增铜绿假单胞菌标准株PAO1中的lasR和rhlR基因,全自动荧光测序仪测序,并用Blast方法检测克隆片段.利用pGEX4T-1载体分别构建lasR/1hlR-pGEX4T-1重组质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并经过免疫印迹实验验证其生物学活性.用硅胶膜培养法建立生物被膜模型,诱导转入了pGFPuv质粒的铜绿假单胞菌PAG0305形成生物被膜,并测定LasR蛋白和RhlR蛋白对生物被膜形成的影响.同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率.以PAO1染色体DNA为模板的PCR结果显示,lasR的全基因序列为720 bp,rhlR基因序列为726bp,经序列分析和同源性比较分别与GenBank中lasR/rhlR基因(登录号:M59425;AE004768)的同源性为100%.大肠杆菌BL21(DE3)分别转化重组质粒lasR/rhlR-pGEX4T-1后,经IPTG诱导和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达的融合蛋白分子质量均为54 ku左右,与预期蛋白质分子质量相同.荧光显微镜观察和测定结果表明,在硅胶膜上PAG0305能够形成典型的发荧光的生物被膜,LasR或Rh1R蛋白(10 mg/L)存在的情况下,PAG0305生物被膜的形成速度在前三天比对照组平均提高40.77%,而且两蛋白单独存在与同时存在时的作用相同.体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率显著高于未经免疫的正常组(P＜0.05).上述结果表明:构建的lasR/rhlR-pGEX4T-1重组质粒能够在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达并具有生物学活性.LasR/RhlR蛋白在体外模型中能够加快铜绿假单胞菌生物被膜的形成速度,是调节铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因素之一.免疫结果表明,重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用,这为进一步开展疫苗研究奠定了基础.
為探討銅綠假單胞菌PAO1中lasR和rhlR基因錶達產物的分子生物學特性,研究它們對銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響以及對小鼠的免疫保護效果,採用聚閤酶鏈式反應(PCR)方法擴增銅綠假單胞菌標準株PAO1中的lasR和rhlR基因,全自動熒光測序儀測序,併用Blast方法檢測剋隆片段.利用pGEX4T-1載體分彆構建lasR/1hlR-pGEX4T-1重組質粒,在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導錶達,併經過免疫印跡實驗驗證其生物學活性.用硅膠膜培養法建立生物被膜模型,誘導轉入瞭pGFPuv質粒的銅綠假單胞菌PAG0305形成生物被膜,併測定LasR蛋白和RhlR蛋白對生物被膜形成的影響.同時用純化的重組蛋白免疫小鼠,菌落計數法檢測免疫組和對照組鼠肺對銅綠假單胞菌的清除率.以PAO1染色體DNA為模闆的PCR結果顯示,lasR的全基因序列為720 bp,rhlR基因序列為726bp,經序列分析和同源性比較分彆與GenBank中lasR/rhlR基因(登錄號:M59425;AE004768)的同源性為100%.大腸桿菌BL21(DE3)分彆轉化重組質粒lasR/rhlR-pGEX4T-1後,經IPTG誘導和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,錶達的融閤蛋白分子質量均為54 ku左右,與預期蛋白質分子質量相同.熒光顯微鏡觀察和測定結果錶明,在硅膠膜上PAG0305能夠形成典型的髮熒光的生物被膜,LasR或Rh1R蛋白(10 mg/L)存在的情況下,PAG0305生物被膜的形成速度在前三天比對照組平均提高40.77%,而且兩蛋白單獨存在與同時存在時的作用相同.體內實驗中,免疫小鼠肺部對銅綠假單胞菌的清除率顯著高于未經免疫的正常組(P＜0.05).上述結果錶明:構建的lasR/rhlR-pGEX4T-1重組質粒能夠在大腸桿菌BL21(DE3)中成功地錶達併具有生物學活性.LasR/RhlR蛋白在體外模型中能夠加快銅綠假單胞菌生物被膜的形成速度,是調節銅綠假單胞菌生物被膜形成的重要因素之一.免疫結果錶明,重組蛋白對小鼠錶現齣一定的保護作用,這為進一步開展疫苗研究奠定瞭基礎.
위탐토동록가단포균PAO1중lasR화rhlR기인표체산물적분자생물학특성,연구타문대동록가단포균생물피막형성적영향이급대소서적면역보호효과,채용취합매련식반응(PCR)방법확증동록가단포균표준주PAO1중적lasR화rhlR기인,전자동형광측서의측서,병용Blast방법검측극륭편단.이용pGEX4T-1재체분별구건lasR/1hlR-pGEX4T-1중조질립,재대장간균BL21(DE3)중유도표체,병경과면역인적실험험증기생물학활성.용규효막배양법건립생물피막모형,유도전입료pGFPuv질립적동록가단포균PAG0305형성생물피막,병측정LasR단백화RhlR단백대생물피막형성적영향.동시용순화적중조단백면역소서,균락계수법검측면역조화대조조서폐대동록가단포균적청제솔.이PAO1염색체DNA위모판적PCR결과현시,lasR적전기인서렬위720 bp,rhlR기인서렬위726bp,경서렬분석화동원성비교분별여GenBank중lasR/rhlR기인(등록호:M59425;AE004768)적동원성위100%.대장간균BL21(DE3)분별전화중조질립lasR/rhlR-pGEX4T-1후,경IPTG유도화SDS-취병희선알응효전영분석,표체적융합단백분자질량균위54 ku좌우,여예기단백질분자질량상동.형광현미경관찰화측정결과표명,재규효막상PAG0305능구형성전형적발형광적생물피막,LasR혹Rh1R단백(10 mg/L)존재적정황하,PAG0305생물피막적형성속도재전삼천비대조조평균제고40.77%,이차량단백단독존재여동시존재시적작용상동.체내실험중,면역소서폐부대동록가단포균적청제솔현저고우미경면역적정상조(P＜0.05).상술결과표명:구건적lasR/rhlR-pGEX4T-1중조질립능구재대장간균BL21(DE3)중성공지표체병구유생물학활성.LasR/RhlR단백재체외모형중능구가쾌동록가단포균생물피막적형성속도,시조절동록가단포균생물피막형성적중요인소지일.면역결과표명,중조단백대소서표현출일정적보호작용,저위진일보개전역묘연구전정료기출.
New strategies are needed for prevention of Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) infections, a widespread disease caused by P. aeruginosa with strong drug resistance. The immunoprotective capacity of the receptor of autoinducers protein LasR/RhlR was examined in the BALB/c mice. At first, specialized expression plasmids were developed to facilitate expression of LasR/RhlR proteins in Escherichia coli (E. coli). Then, biofilms were grown from clinical isolated P. aeruginosa PA0305 to investigate the relative contributions of cell signaling for biofilm formation. Morphological characters of biofilm were quantified using Image-Pro Plus software. Fluorescence analysis demonstrated that cell signal molecule LasR/RhlR significantly (P ＜ 0.05) influenced development of P. aeruginosa biofilm. Active immunization of mice with LasR/RhlR was found to provide significant protection against homologous challenge with P. aeruginosa in mice lungs. In 10 days after lungs inoculation, the bacterial clearance rate of the immunized mice was clearly higher than that of non-immunized groups on the basis of microbiological and histological assays. The protective effects of immunization with LasR and Rh1R together were the same as the result of LasR or Rh1R immunized mice alone. These data indicate that the manner ofLasR, Rh1R or both is an important determinant of immunoprotection in mice lungs infection.
